Je leest:

TNO in vitro modellen van het maag-darm kanaal als alternatief voor dierproeven

TNO in vitro modellen van het maag-darm kanaal als alternatief voor dierproeven

Auteur: | 30 oktober 2002

TNO heeft modellen ontwikkeld voor het maag-darm kanaal. Deze in vitro modellen bootsen de processen in the maag-darm kanaal zo nauwkeurig na dat het aantal experimenten met proefdieren sterk verminderd kan worden. Bovendien is de voorspellende waarde voor de mens van deze in vitro modellen groter dan die van experimenten met knaagdieren of honden.

Het maag-darm kanaal is slecht toegankelijk voor het nemen van monsters voor onderzoek. Grote hoeveelheden proefdieren (met name knaagdieren en honden) worden dan ook opgeofferd om onderzoek te kunnen doen naar de verterings-processen die plaats vinden in het maag-darm kanaal. Modellen die de werkelijkheid voldoende nabootsen kunnen het gebruik van proefdieren terug dringen.

FIDO; het in vitro model voor de hond

Om een complete en gebalanceerde voeding voor de hond te produceren is het noodzakelijk om de nutriënten behoefte van de hond te weten alsook de beschikbaarheid van de nutriënten uit de voeding. Omdat diervoerfabrikanten beperkt zijn in het uitvoeren van dierproeven met honden is het belangrijk om alternatieven te hebben voor dit soort onderzoek.

Daarom heeft TNO een alternatieve methode voor onderzoek ontwikkeld, gevalideerd en toegepast. Gebaseerd op een intensieve literatuurstudie naar de fysiologie van het maag-(dunne)darmkanaal van de hond is het dynamisch in vitro maagdarm model van de mens (TIM; zie ook het artikel “De TNO in vitro modellen van het maag-darm kanaal; werktuigen voor een gezonde voeding” op de website van Kennislink) specifiek aangepast aan de condities in de maag en dunne darm van de gezonde, volwassen hond. Dit hondenmodel kreeg de naam FIDO (functional gastrointestinal dog model). Vervolgens is het model gevalideerd voor zowel de technische aspecten alsook voor de in vivo situatie.

Daarnaast is de gevoeligheid van het model getest en geëvalueerd. Verder onderzoek naar specifieke vraagstellingen zoals de vertering en beschikbaarheid voor absorptie van nutriënten uit hondenvoeding werden uitgevoerd met dit model.

Afb. 1Schematische weergave van FIDO. A. maag compartiment; B. pylorische sphincter; C. duodenum (= twaalfvingerige darm) compartiment; D. peristaltische klep; E. jejunum (= dunne darm) compartiment; F. peristaltische klep; G. ileum (= dunne darm) compartiment; H. klep tussen ileum en dikke darm; I. pH electrodes; J. maag-secretie met zuur en enzymen; K. duodenum-secretie met gal, alvleeskliersap en bicarbonaat; L. secretie van bicarbonaat om de pH te reguleren; M. filter systeem; N. holle vezelmembraan; O. water absorptiesysteem; P. gesloten dialysesysteem

Ontwikkeling van het model

Het model is opgebouwd uit vier compartimenten die achtereenvolgens de maag, en de drie verschillende delen van de dunne darm, het duodenum, het jejunum en het ileum, nabootsen (zie afbeelding 1). Elk compartiment bestaat uit een glazen buitenwand met daarin een flexibele siliconen huls. Deze huls is omgeven door water dat ervoor zorgt dat de temperatuur in het model op lichaamstemperatuur blijft. Daarnaast kunnen deze hulzen samengeknepen worden door het verhogen van de waterdruk. Op deze manier worden de peristaltische bewegingen van het maag-darm kanaal nagebootst. Geleidelijke passage van de voeding door de opeenvolgende compartimenten vindt plaats door middel van peristaltische kleppen tussen elk van de compartimenten (zie afbeelding 2). De zuurtegraad in elk van de compartimenten wordt nauwkeurig gecontroleerd met pH elektroden en aangepast dan wel gehandhaafd door middel van secretie van zuur- en loog-oplossingen. Dit betekent dat er in de maag een fysiologische daling van de pH na inneming van een maaltijd plaatsvindt (van pH 7.0 naar pH 1.9 binnen 3 uur). In het duodenum wordt de voeding vervolgens weer geneutraliseerd (pH=6.2), terwijl in het jejunum en het ileum de pH verder oploopt naar, respectievelijk pH 6.5 en pH 7.0. Daarnaast vindt er ook secretie plaats van verteringssappen in de maag en het duodenum. In de maag worden de enzymen lipase en pepsine toegevoegd en in het duodenum vindt secretie plaats van alvleesklier-sappen en gal. Aan zowel het jejunum als het ileum compartiment zijn dialysesystemen gekoppeld die zorgen voor de absorptie van de verteringsproducten en water, waarmee de opname in het lichaam nagebootst wordt. De genoemde parameters zijn vanuit de literatuur vertaald in een computerprogramma. Dit computerprogramma controleert tijdens een experiment continue of de gemeten waarden overeen komen met de waarden in de computer. Indien er afwijkingen worden geconstateerd worden deze bijgestuurd door middel van de computer. Het hele model is op deze manier computer gestuurd en er vindt continue dataregistratie plaats tijdens de experimenten. Naast de pH is ook de passagesnelheid van de voeding door het maag-darm kanaal een belangrijke factor bij de vertering en beschikbaarheid van nutriënten. De passagetijd van de voeding wordt door middel van de computer gereguleerd aan de hand van een vooraf ingestelde ledigingcurven. Deze ledigingcurven komen overeen met de fysiologische maaglediging en darmpassage van de voeding bij de hond (zie afbeelding 3).

Afb. 2Schematische weergave van een peristaltische klep. Door het openen van de 3 klepjes in chronologische volgorde wordt een deel van de inhoud van het ene compartiment naar het andere compartiment getransporteerd.

Afb. 3Gemiddelde fysiologische ledigingcurves van de maag (doorgetrokken lijn; open symbolen) en de dunne darm (doorgetrokken lijn, dichte symbolen) en de pH in de maag (gestippelde lijn) van jonge volwassen honden na inname van een vaste maaltijd.

Validatie van het in vitro model ten opzichte van in vivo gegevens

Naast een technische validatie van het model (in vitro) is de relatie met de situatie in de hond (in vivo) ook zeer belangrijk. Om dit te bestuderen zijn acht verschillende hondenvoeren in dit model getest op de eiwitvertering. De eiwitvertering van deze voedingen werden tevens getest in ileum-gefistuleerde honden (honden met een kunstmatige uitgang op het einde van de dunne darm). Op deze manier kon een goede vergelijking tussen de in vivo en in vitro eiwitvertering gemaakt worden. Uit de resultaten blijkt dat de experimenten zeer reproduceerbaar zijn en dat er een duidelijke overeenkomst bestaat tussen de in vivo situatie en de in vitro situatie in FIDO (zie afbeelding 4).

Afb. 4Vergelijking van eiwit vertering in vivo (in de hond) en in vitro (in FIDO) van 8 verschillende hondenvoeren.

Naar aanleiding van deze bevindingen en van eerdere bevindingen met het model waarbij het varken, het kalf en de mens nagebootst werden, kan geconcludeerd worden dat het model een geschikt alternatief is voor dierproeven met betrekking tot voedingsonderzoek.

Toepassing van het model

Om de beschikbaarheid van mineralen uit hondenvoer te onderzoeken, werd er een studie uitgevoerd waar gekeken werd naar het vrijgekomen calcium (Ca) en fosfor (P) uit een blikje hondenvoer. Hiervoor werden drie commercieel verkrijgbare blikvoedingen gebruikt. Tevens werd bestudeerd of de beschikbaarheid van het Ca en P verhoogd kon worden door middel van het toevoegen van Ca- en P-supplementen, en door middel van het verlagen van de pH in de dunne darm, wat een betere oplosbaarheid van de mineralen tot gevolg heeft. Als controle voeding werd een standaard ontbijt meegenomen, waarvan de beschikbaarheid van Ca bekend is.

Uit de resultaten bleek dat bij deze blikvoedingen de beschikbaarheid voor opname van Ca (max. 21%) en P (max. 44%) in het model laag was. Het standaardontbijt had een vergelijkbare beschikbaarheid van Ca in het hondenmodel als in het model van de mens (TIM). De lage beschikbaarheid van Ca uit het hondenvoer wordt mogelijk veroorzaakt door de (verzadigde) vetten in het voer. Verzadigde vetzuren kunnen “zepen” vormen met het Ca, waardoor het Ca onoplosbaar wordt. Hierdoor is opname in het dialysesysteem van FIDO (en in een echte hond) niet meer mogelijk. In de verschillende hondenvoeren die getest werden werd een duidelijk verschil waargenomen in de relatieve mate van beschikbaarheid (uitgedrukt in procenten van de hoeveelheid die is toegevoegd aan het model) van Ca en P tussen de onderlinge voeren (zie afbeelding 5). Dit wordt mogelijk veroorzaakt door de Ca- of P-bron. Bot bijvoorbeeld, bevat veel Ca en P maar dit is slecht beschikbaar Ca en P.

Afb. 5Beschikbaarheid voor opname van calcium en fosfor uit verschillende dieëten in FIDO.

Wat leert FIDO ons

Het model blijkt een zeer geschikt alternatief te zijn voor in vivo studies met betrekking tot onderzoek naar de vertering en beschikbaarheid voor absorptie van nutriënten uit verschillende hondenvoedingen. Technisch gezien is het model in staat om er zowel droogvoer als blikvoer in te onderzoeken. Uit de resultaten blijkt bovendien dat de ingestelde condities in het model ook goed overeen komen met de gemiddelde in vivo gegevens. Ook komen de resultaten van verschillende soorten droogvoer goed overeen met de gegevens gevonden bij ileum gefistuleerde honden. Het model maakt het mogelijk om mechanistisch te onderzoeken wat het effect van bepaalde parameters is op de vertering van een voer, zonder dat hiervoor ethisch bezwaarlijke dierproeven uitgevoerd hoeven te worden. FIDO is dan ook een diervriendelijk alternatief.

Voedselcomponenten kunnen kanker veroorzaken of juist helpen voorkomen

De blootstelling van mensen aan potentieel kankerverwekkende (mutagene en carcinogene) verbindingen via de voeding is onvermijdelijk. Deze DNA-schade veroorzakende stoffen zijn onder andere aanwezig in gebraden vlees en vis. Maar er zijn ook bepaalde voedingsbestanddelen uit groenten en fruit bijvoorbeeld, die het ontstaan van kanker tegengaan. De mate van blootstelling aan deze schadelijke en beschermende stoffen hangt niet alleen af van de samenstelling, maar ook van de bereidingswijze van ons dieet. Bij de beoordeling van het al dan niet schadelijk of juist beschermend zijn van voedselbestanddelen is tot nu toe weinig aandacht besteed aan de betekenis van specifieke processen die zich in het maag-darmkanaal afspelen. Zoals de beschikbaarheid voor opname in het lichaam van de betreffende componenten. En er zijn ook interacties tussen voedingscomponenten die tijdens passage door het maag-darmkanaal schadelijke stoffen kunnen vormen.

Maar de schadelijke componenten kunnen door micro-organismen in het maag-darmkanaal (de darmmicrobiota) ook weer afgebroken worden. Of bepaalde voedselbestanddelen worden omgezet in gunstige verbindingen die DNA-schade voorkomen. De reden dat dit tot nu toe nog nooit onderzocht is, is omdat het maag-darmkanaal slecht toegankelijk is voor het nemen van monsters voor onderzoek. Vaak worden hiervoor proefdieren gebruikt. Echter, het vertalen van de resultaten (verkregen met muizen-proeven) naar de mens is niet altijd mogelijk vanwege de verschillen in fysiologie tussen (proef)dier en mens.

De TNO modellen in onderzoek naar kanker inducerende verbindingen en beschermende effecten van voedselbestanddelen De door TNO ontwikkelde dynamische in vitro maag-darmmodellen bootsen de fysiologische condities in het maag-darmkanaal van de mens zo goed na, dat het thans mogelijk is om de bovengenoemde processen te bestuderen, zonder gebruik van proefdieren en met een beter voorspellende waarde voor de mens dan wanneer proefdieren gebruikt worden. Deze modellen zijn gebruikt bij het onderzoek naar de vrijgekomen voedselmutagenen en hun interactie met beschermende componenten van de voeding. Ook is gekeken naar de vorming van schadelijke stoffen uit voedselbestanddelen ter plekke in het maag-darm kanaal. Het model van de dikke darm is gebruikt bij onderzoek naar de omzetting door de darmmicrobiota van voedingscomponenten in potentieel kankerbeschermende stoffen. Hieronder volgen een paar voorbeelden.

Beschikbaarheid voor opname in het lichaam van schadelijke componenten en de werking van beschermende stoffen Schadelijke componenten uit gebraden vlees en vis (verhoogd aanwezig in geblakerd vlees van de BBQ) zijn in hoge mate beschikbaar voor opname in het lichaam (zie afbeelding 6). Deze DNA-schade veroorzakende stoffen verhogen de kans op kanker. Mutaties in het DNA veroorzaakt door deze mutagene stoffen werden effectief gereduceerd door thee. Zowel groene als zwarte thee bleken effectieve remmers te zijn, met name wanneer thee en de mutagene stof tegelijk in het model werden gebracht. Om de invloed van voedingscomponenten (thee in de melk, of de aanwezigheid van een compleet ontbijt) op dit proces te onderzoeken, werd thee met verschillende soorten melk of met een compleet ontbijt in het model gebracht. De beschermende werking van thee bleek sterk geremd te worden door de toevoeging van melk (zie afbeelding 6) en werd zelfs volledig teniet gedaan als er tegelijkertijd een ontbijt aanwezig is in het maag-darmkanaal. Bepaalde verbindingen uit thee, de catechinen, zijn verantwoordelijk voor de beschermende activiteit van thee. De afname van de beschermende activiteit van thee met melk bleek overeen te komen met de binding van catechinen aan melk-eiwitten.

Afb. 6Antimutagene activiteit van thee en het effect van verschillende soorten melk. Zwarte thee (ZT) heeft een hoge antimutagene activiteit (uitgedrukt als procent remming van de mutagene activiteit van een mutagene stof). Vette melk remt deze activiteit voor ongeveer een derde deel. Halfvolle en magere melk remmen het effect van thee nog veel sterker.

Vorming van carcinogene stoffen in het maag-darmkanaal

Nitraat wordt opgenomen in ons lichaam uit het voedsel en drinkwater. Tevens wordt het door ons lichaam uitgescheiden in de mondholte. Bacteriën in de mondholte zetten nitraat om in nitriet. Het nitriet dat doorgeslikt wordt kan in de maag reageren met aminen, die onder andere voorkomen in vis, tot schadelijke nitrosamine verbindingen. Deze verbindingen zijn enorm carcinogeen voor knaagdieren en er wordt aangenomen dat dit ook voor mensen geldt. Om de vorming van deze verbindingen in het maag-darmkanaal te bestuderen, werd er vis in het in vitro model gebracht. Vier van de zes onderzochte vissoorten, namelijk kabeljauw, haring, schol en koolvis, bleken in staat om de vorming van nitrosaminen te induceren. Makreel en zalm vertoonden deze eigenschap niet (zie tabel 1). Vitamine C en groene en zwarte thee bleken de vorming van nitrosaminen te remmen. Ook spinazie had een remmende werking.

Tabel 1Vorming van nitroamines in TIM na de inname van 100 g verschillende soorten verse vis in combinatie met nitriet.

TNO in vitro modellen: een diervriendelijk alternatief

Uit ethisch oogpunt is het niet mogelijk om te onderzoeken wat er allemaal gebeurt tijdens de vertering in het maag-darmstelsel van mens en dier. Daarom worden er proefdieren gebruikt wat ook weer ethische bezwaren oplevert. De TNO in vitro modellen bieden de mogelijkheid om de verteringsprocessen zo natuurgetrouw mogelijk na te bootsten zonder dat daar proefdieren voor worden gebruikt. De modellen vergemakkelijken het onderzoek aanzienlijk en zijn dus zeer diervriendelijk.

Zie ook:

Dit artikel is een publicatie van Nederlands Instituut voor Biologie (NIBI).
© Nederlands Instituut voor Biologie (NIBI), sommige rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 30 oktober 2002

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.