Als het gaat om de winning van bijvoorbeeld olie voor biobrandstoffen of bestanddelen voor voedsel, diervoeding, of andere grondstoffen zijn algen niet per se de meest efficiënte bron. Dat wil zeggen: voor het voortbestaan van het organisme zelf doen ze wat ze doen op een biologisch geweldige manier. Economisch is dat nog een ander verhaal. Op verschillende manieren proberen onderzoekers de productie van bruikbare stoffen door algen in kunstmatige systemen op te voeren tot economisch rendabele niveaus. Veel onderzoek is gericht op het vinden van optimale kweekomstandigheden en van efficiënte oogst- en extractietechnieken.
Een andere mogelijkheid om algen efficiënter in te zetten in productiesystemen is genetische modificatie om betere ‘productiestammen’ te maken. Bij genetische modificatie worden nieuwe genen ingebracht of bestaande genen verwijderd. Het totale genenpakket bepaalt uiteindelijk wat voor chemische omzettingen er in de alg plaats kunnen vinden. Door de samenstelling van dat genenpakket aan te passen kunnen dus betere productiestammen ontwikkeld worden.
De eerste ervaring met genetische modificatie van algen stamt uit 1970. Toen werd de cyanobacterie Synechocystis op een stabiele manier voorzien van genetisch materiaal van een andere bacterie. De eerste modificatie van een ‘echte’, eukaryote alg stamt uit 1989. Toen werd Chlamydomonas reinhardtii voor het eerst op een stabiele manier voorzien van een vreemd gen. Sindsdien is deze C. reinhardtii uitgegroeid tot een waar proefkonijn onder de algen wat betreft genetische modificatie. Ruim twintig jaar na de eerste geslaagde genetische experimenten kunnen in laboratoria diverse stoffen geproduceerd worden door deze alg: van olie voor biobrandstof, tot menselijke afweereiwiten en zelfs tot een potentieel malariavaccin aan toe.
Genetische modificatie technieken
De genetische modificatie van eukaryote algen is wat ingewikkelder dan die van blauwalgen. De laatste zijn feitelijk bacteriën en voor deze relatief eenvoudige micro-organismen bestaan al veel langer technieken voor genetische aanpassingen. Een van de methodes om eukaryote algen te voorzien van een vreemd gen is de kern of de chloroplast (het celonderdeel waar de fotosynthese in plaatsvindt) te bombarderen met kleine deeltjes waar het vreemde DNA opgeplakt zit. Dit wordt biolistiek genoemd. Met behulp van een ‘genpistool’ worden minuscule deeltjes van wolfraam of goud dwars door een te modificeren cel geschoten. Aan de buitenkant van die deeltjes zit een laagje met het te transplanteren genetisch materiaal. Bij de tocht van de ‘genetische kogels’ door de cel blijft het DNA in bepaalde gevallen op cruciale plekken in de cel achter. Naast deze genetische beschietingen zijn er ook manieren om met behulp van minuscule glasbolletjes of met chemicaliën de cel zó te prikkelen dat vreemd DNA wordt opgenomen.
Behalve het toevoegen van vreemd DNA is het ook mogelijk gebleken om bestaande genen uit te schakelen. Wanneer in een cel DNA-informatie wordt omgezet in een concreet eiwit, gebeurt dit via een tussenstap: via RNA. Het blijkt mogelijk om die tussenstap te blokkeren met een ‘spiegelbeeldige’, of ‘tegengestelde’ RNA-code. Dat spiegelbeeldig RNA past precies op het (functionele) enkeldradig RNA, waardoor (niet functioneel) dubbeldradig RNA ontstaat. Zo’n tegengestelde, blokkerende code wordt antisense genoemd.
Doelen van genetische modificatie
Blauwalgen zijn veelbelovende productieorganismen voor kleine moleculen die uitgescheiden kunnen worden, zoals ethanol, butanol, vrije vetzuren en andere organische zuren. Eukaryote algen hebben de voorkeur wanneer het belangrijk is dat de producten binnen de cel worden opgeslagen, zoals in geval van bijvoorbeeld olie. Cyanobacteriën zijn niet goed uitgerust om olie in grote hoeveelheden op te slaan. Bij die opslag zijn veel verschillende moleculen betrokken. Het identificeren en inbrengen van alle genen die hiervoor nodig zijn is voorlopig nog teveel gevraagd.
De genetische verandering van eukaryote algen heeft verschillende doelen. De eerste is het verbeteren van de omzetting van zonlicht in bruikbare energie voor de cel: de fotosynthese. De productie van algen is afhankelijk van zonlicht en CO2. Onder normale omstandigheden is licht niet de limiterende factor. Sterker nog: een alg wordt onder normaal daglicht met zoveel fotonen bestookt dat die de productie juist remmen. Dat fenomeen wordt lichtinhibitie genoemd. Een van de strategieën van genetische modificatie is erop gericht om de ‘antennes’ van de alg voor het opvangen van fotonen zó aan te passen dat de productie niet meer wordt geremd bij een overmaat aan fotonen.
Een tweede doel van genetische modificatie is om algen extra stoffen te laten produceren die ze van nature op zijn best in kleine hoeveelheden produceren. Een voorbeeld daarvan zijn toxines die een antibacteriële werking kunnen hebben. Ook het extra laten produceren van olie of onderdelen daarvan hoort tot de mogelijkheden. Daarvoor kunnen genen worden geïntroduceerd die lipiden produceren of opslaan. Andere genen, die de afbraak van lipiden stimuleren, kunnen juist worden geremd. Daarnaast worden ook genen in de algen gebracht die coderen voor enzymen die de kwaliteit van de geproduceerde oliën en vetten verbeteren. Een olie of vet dat goed genoeg is voor een alg is dat immers niet per se voor industriële toepassingen.
Een derde lijn van onderzoek richt zich op het introduceren van compleet nieuwe stoffen in de alg. Van nature maken algen bijvoorbeeld geen waterstof, alcohol of bepaalde vetzuren. Door introductie van nieuwe genen kunnen algen deze energiedragers mogelijk wél produceren. Naast die energiedragers is er ook een groeiende lijst eiwitten, tot medicijnen aan toe, die via genetische modificatie door algen worden geproduceerd, zij het alleen nog op experimentele schaal.
Genetische modificatie van blauwalgen
Net zo min als algen, zijn cyanobacteriën geëvolueerd om aan onze behoefte aan biobrandstoffen of andere nuttige producten tegemoet te komen. Hun ‘evolutionaire streven’ is zuiver gericht op zo goed mogelijk overleven en vermeerderen onder allerlei verschillende natuurlijke omstandigheden. Toch zorgen de natuurlijke biochemische processen van deze micro-organismen vaak voor verbindingen die ook interessant zijn voor de mens. Zelfs de celonderdelen die voor die productie zorgen zijn vaak bruikbaar voor dat doel. Dat is geen toeval. Zo zijn de fossiele brandstoffen die wij grootschalig gebruiken en die wij mogelijk willen vervangen door biobrandstoffen uit algen ooit ook door levende organismen gemaakt.
Hieruit kun je opmaken dat wat zich chemisch afspeelt in de cel erg dicht in de buurt ligt van wat wij willen dat de cel voor ons doet. Aangezien alle processen gestuurd worden door de activiteit van enzymen, en het voorkomen van enzymen genetisch is vastgelegd, is het goed denkbaar dat wij met goed geplande genetische ingrepen die processen naar onze hand kunnen zetten.
Net zoals algen voeren cyanobacteriën fotosynthese uit. Daarbij wordt zonne-energie gebruikt om CO2 te reduceren tot organische verbindingen. De biochemische route (de zogenoemde Calvincyclus) leidt onder andere tot de intracellulaire vorming van glyceraldehyde 3-fosfaat. Vanuit deze verbinding kan de cel vervolgens nieuw celmateriaal maken, zoals suikers, celwanden, eiwitten of DNA. Het glyceraldehyde 3-fosfaat kan door de cyanobacterie ook worden omgezet in pyruvaat (pyrodruivenzuur). Dus: CO2 + zonlicht –> pyruvaat.
Er zijn veel zogenoemde chemotrofe organismen die hun energie halen uit de verbranding van chemische stoffen in hun omgeving. Een voorbeeld is bakkersgist, dat pyruvaat omzet in ethanol. Daarvoor zijn slechts twee enzymen nodig. Bakkersgist heeft dus ook twee genen in het DNA die voor deze enzymen coderen: het gen pdc codeert voor pyruvaat-decarboxylase en adh codeert alcoholdehydrogenase. Een nog eenvoudiger voorbeeld is de biochemische productie van melkzuur uit pyruvaat door verschillende bacteriën. Daarvoor hebben ze maar één gen en één enzym nodig: ldh voor de productie van lactaat-dehydrogenase.
De strategie om een ‘nieuwe blauwalg te maken’ die uit pyruvaat ethanol of melkzuur produceert laat zich aan de hand van die voorbeelden raden: voorzie het organisme van de juiste genen, zorg dat deze genen tot expressie komen (dat wil zeggen: de enzymen daadwerkelijk maken), voorzie de cellen van licht en CO2, en het pyruvaat dat ze gaan produceren wordt door de aangebrachte enzymen omgezet in het gewenste product. Zo kan CO2 plus zonlicht wellicht worden omgezet in melkzuur. Melkzuur kan een grondstof zijn voor bioplastics.
Knippen en plakken …
In principe is het overbrengen van bijvoorbeeld het ldh-gen uit een zuivelbacterie naar een blauwalg een goed beschreven genetische techniek. Een veelgebruikte methode is de zogenoemde homologe recombinatie. Het ldh-gen bijvoorbeeld wordt eerst uit het DNA van de zuivelbacterie ‘geknipt’. De natuur heeft moleculair biologen daarvoor een hele serie enzymatische scharen, ofwel specifieke enzymen geleverd. Vervolgens plak je aan het begin en het eind van dat stukje DNA stukjes genetisch materiaal die identiek, ofwel homoloog zijn aan natuurlijke stukjes DNA van de blauwalg. Ook dat gebeurt met specifieke enzymen uit de gereedschapkist van de moleculair bioloog. Je hebt dan een stuk DNA, xx-ldh-yy dat je kunt vermeerderen via een tussenstap en vervolgens kunt aanbieden aan de blauwalg.
Soms zal het stuk DNA de cel binnenkomen en dat kan dan tot ‘recombinatie’ van de homologe xx en yy stukken van het blauwalg-DNA leiden, inclusief het tussengeplakte stukje ldh. Daarmee is het gen ingebouwd in een blauwalgcel (zie onderstaande figuur). Je hebt dan een zogenoemde transformant die je via selectietechnieken kunt isoleren en verder opkweken.
… en dan echt produceren
Daarmee heb je nog niet per se een blauwalg die melkzuur produceert, laat staan in interessante hoeveelheden. Hier ligt de echte uitdaging voor het team van moleculair biologen, biochemici, microbieel fysiologen en procestechnologen. Allereerst moet het gen op het gewenste niveau tot expressie komen. Er moet voldoende enzym worden gemaakt door de cel om de biochemische omzetting goed te laten verlopen. Er zijn verschillende moleculaire strategieën die zich hierop richten. Het kiezen van de beste locatie van het gen binnen het DNA van de blauwalg is belangrijk, net als het kiezen van een goede ‘promotor’. Dat is een DNA-sequentie voorafgaand aan het gen dat geactiveerd moet worden. Verder is het aantal kopieën van het vreemde gen dat in één blauwalgchromosoom wordt ingebouwd van belang.
De cyanobacterie zelf is niet gebaat bij de door ons gewenste hoge productie van, in dit geval, melkzuur. Ingrijpen in de biochemie van de cel kan ook allerlei nadelige effecten hebben op de natuurlijke overleving, groeisnelheid, gevoeligheid en stabiliteit van de bacterie.
Synthetische biologie, ondersteund door bio-informatica en wiskundige modellen, helpt om op basis van kennis over genetica, enzymen, biochemie en fysiologie te voorspellen hoe je het gedrag van de cel kunt sturen, waar de bottlenecks in de stofwisseling liggen, waar de grenzen liggen en hoe je optimale productie kunt bereiken.
Vanuit de fysiologie bedenk je de beste condities om de blauwalg zijn werk te laten doen, de procestechnologie ontwerpt de reactor met het juiste lichtregime, de beste menging en de gunstigste geometrie.
Beter met blauwalg
In veel opzichten zijn cyanobacteriën eenvoudiger en gemakkelijker genetisch te modificeren dan de eukaryote algen. Het zijn prokaryote organismen met een relatief eenvoudige genetisch structuur. Bovendien groeien zij in het algemeen sneller en gaan ze efficiënter om met licht. Het is dan ook niet verwonderlijk dat de belangstelling voor deze groep organismen in de biotechnologie toeneemt. Het zal ook duidelijk zijn dat zij zeer breed inzetbaar zijn. Door de juiste genetische ‘cassette’ in te brengen komt een groot scala aan producten binnen bereik. Wanneer die cassette naar behoren functioneert hebben we een systeem tot onze beschikking dat gezien kan worden als een katalysator die zonder bijproducten een stof produceert uit CO2 en zonlicht en verder niets nodig heeft.
Vanuit pyruvaat kunnen heel veel stoffen worden gemaakt. Behalve het al genoemde melkzuur en etanol kun je ook butanol, butaandiol en vergelijkbare energiedragers uit deze stof maken. Maar niet alleen producten op basis van pyruvaat komen in aanmerking voor ‘cyanofabricage’. Je kunt ook denken aan de productie van kleurstoffen en voedingscomponenten. In feite leert de systeembiologie dat alle stoffen waarvan de structuur niet al te veel afwijkt van de structuur van de verbindingen die de cel al van nature maakt, kandidaten zijn. Gezien de enorme variatie in biochemische omzettingen in de natuur heeft de zoektocht naar de juiste (combinatie van) genen die het celeigen product omzetten naar de gewenste verbinding al snel kans van slagen. Het is lastiger om de stap naar een economisch rendabel proces te zetten. Lastiger, maar met voortschrijdend inzicht in de microbiologie steeds vaker wél binnen bereik.
Het inzetten van genetisch gemodificeerde ‘fotosynthetiseerders’ als alternatieve producenten van nuttige chemicaliën en brandstoffen is in principe altijd duurzaam en daarom de moeite van het onderzoeken waard. De risico’s zijn beperkt. Enerzijds maak je gebruik van het enorme biochemische potentieel van voor mens en dier ongevaarlijke blauwalgen, maar je minimaliseert hun overlevingskansen ‘in het wild’. Door hun enorme flexibiliteit, bedoeld om te overleven, te exploiteren voor onze eigen doelen, ontnemen we de blauwalgen de mogelijkheid om adequaat te reageren op de wisselende condities in de natuurlijke omgeving. De enige plaats waar ze zich optimaal kunnen profileren is de fotobioreactor waarvoor ze zijn ontworpen door de moleculair biologen. Hoe dan ook zul je verspreiding van genetisch gemodificeerde algen willen voorkomen. Er zal dan ook altijd onder strikte, wettelijk voorgeschreven condities gewerkt worden.
Kunstmatige selectie
Behalve via het inbouwen van een nieuwe eigenschap door genetische modificatie, kun je ook op zoek gaan naar die eigenschap die misschien al in een heel klein deel van een populatie algen aanwezig is. Maar hoe vind je die paar exemplaren die die gewenste eigenschap hebben? Op deze vraag geeft het boek Geobiologie of inleiding tot de milieukunde van Baas Becking uit 1934 het antwoord: alles is overal, maar het milieu selecteert. Becking zegt hier feitelijk dat alle eigenschappen overal vertegenwoordigd zijn en dat je door aanpassing van het milieu één van die eigenschappen het voordeel kunt geven. Dit principe is op allerlei schalen en manieren toepasbaar.
Stel dat alle dieren in Artis ontsnapt zijn en door elkaar heen lopen. De verzorgers willen graag de boel weer op orde hebben en besluiten het vangen van de dieren alfabetisch aan te pakken: eerst moeten de apen gevangen worden. In eerste instantie rennen de verzorgers met schepnetten achter de apen aan, maar die zijn natuurlijk niet voor één gat te vangen.
Daarom slaat een verzorger het boek van Baas Becking open en besluit om de apen met een selectief milieu te gaan selecteren uit de grote groep dieren. De verzorgers verstoppen een tros bananen in een hoge boom. Zo selecteren de verzorgers voor twee eigenschappen: goed kunnen klimmen en van bananen houden.
De kans dat de verzorgers olifanten (houden wel van bananen, maar klimmen moeizaam in bomen) of leeuwen (kunnen wel klimmen, maar houden niet van bananen) in de bomen aantreffen is erg klein. Het gecreëerde milieu selecteert voor alle twee de eigenschappen tegelijkertijd.
In de microbiële dierentuin werkt het principe van Baas Becking nog beter. Omdat algen zich sneller vermenigvuldigen dan apen, verspreiden de eigenschappen waarop geselecteerd wordt zich vlot in een populatie. Op die manier kan een eigenschap die eerst amper zichtbaar was, snel overheersend worden in een groep.
Survival of the fattest
Stel nu dat we graag een alg tjokvol met olie willen vinden. Die eigenschap is al ergens aanwezig; alles is immers overal. Het gaat er dan ook om een milieu te creëren waar zo’n alg er profijt van heeft om vol olie te zitten. Olie is voor algen een koolstof- en energieopslag, zoals vet dat voor mensen is. Er zijn allerlei milieus te bedenken waarin opslag van olie een voordeel is. Energie en koolstof komen bijvoorbeeld goed van pas in lange donkerperiodes of als het koud is. Algen hebben echter ook energie en koolstof nodig voor celdeling en om voedingsstoffen zoals fosfaat en stikstof uit het water op te nemen. Stel dat je de algen alleen in het donker voedingsstoffen geeft, dan is de algensoort met veel olie spekkoper. Hij (of zij) heeft namelijk energie en koolstof tot zijn beschikking en kan in het donker toch nog nutriënten opnemen die worden gebruikt om nieuwe fotomachinerie aan te maken en om ’s nachts te delen. De extra fotomachinerie zorgt ervoor dat er de volgende dag met hogere efficiëntie nieuwe olie gemaakt kan worden, wat de volgende nacht weer gebruikt wordt om de voorsprong nog verder uit te bouwen. Zijn buurman zonder olie kan slechts lijdzaam toekijken hoe de olie-alg zich vermenigvuldigt. Met deze kennis kun je dus voor de eigenschap ‘olieproductie’ gaan selecteren.
Hoe werkt dit in de praktijk? Je gaat naar de dichtstbijzijnde vijver en vult een buisje met algen. Terug in het lab gooi je die in een reactor. Vervolgens geef je de algen overdag genoeg licht en CO2 om olie te maken, maar geen nutriënten om te delen. Die geef je ze pas ’s avonds. Het gevolg zal zijn dat alleen de dikke ‘olie-algen’ nutriënten kunnen opnemen en kunnen delen omdat ze overdag energie en koolstof, in de vorm van olie hebben opgeslagen. Als je elke dag een deel van de algen verwijdert, wordt de cultuur na een tijdje volledig overgenomen door olie-algen. Op die manier creëer je een kunstmatig milieu waarin alleen de algen overleven die olie ophopen.
Kunstmatige selectie in de praktijk
Dit principe klinkt leuk, maar werkt het ook? Ja en nee. Aan het begin van de rit is er een hele dierentuin van algensoorten aanwezig en na verloop van tijd wordt het systeem inderdaad een monocultuur. Maar helaas maakt die alg vervolgens geen olie. De alg wordt wel dik, dat dan weer wel. Algen maken niet alleen olie of vet als energie- en koolstofopslag, maar ook zetmeel. Het beschreven kunstmatige milieu selecteert op de survival of the fattest, maar dat kan blijkbaar net zo goed of zelfs beter op basis van zetmeel zijn. Het milieu moet blijkbaar nog specifieker worden gemaakt.
Op dit moment vindt het merendeel van het onderzoek naar algen plaats op laboratoriumschaal. Het uiteindelijke doel is echter dat algen op grote schaal geteeld gaan worden. De aanpak via kunstmatige selectie zoals hier is beschreven kan dan grote voordelen bieden. Een grote bedreiging voor een stabiele productie is namelijk vervuiling door andere algen. In de vrije natuur van een algenkweekvijver staan ‘wilde algen’ te dringen om de concurrentie aan te gaan met de alg die het in het laboratorium zo goed deed, of die je zorgvuldig genetisch in elkaar hebt geknutseld. Het is goed mogelijk dat de wilde, ongewenste algen deze concurrentieslag winnen omdat ze bijvoorbeeld sneller groeien dan de gewenste olieproducerende algen.
Een mogelijke oplossing is om met gesloten kweeksystemen te werken en door sterilisatie ervoor te zorgen dat buitenstaanders het systeem niet binnen kunnen dringen. Theoretisch gezien is dit mogelijk, maar op grote schaal is het praktisch onhaalbaar en vooral erg kostbaar. Door kunstmatige selectie is het niet erg als er andere algen in de kweek komen. Je selecteert immers niet op die ene soort alg, maar op die ene eigenschap. Alle algen met die eigenschap zijn welkom in het systeem. Met een alg van buiten kunnen twee dingen aan de hand zijn. Als de alg minder olie maakt dan de algen die al in het systeem zitten, heeft hij ’s avonds amper energie en koolstof om te delen. Hij verdwijnt dan vanzelf weer uit het systeem omdat hij de concurrentieslag met de andere algen verliest. Als de alg meer olie kan produceren, neemt hij langzaam het systeem over. Daardoor verandert wel het type alg in het systeem, maar de eigenschap van olie maken verandert niet. Sterker nog: die is zelfs verbeterd.