Van duizenden eiwitten van de gist Saccharomyces cerevisiae zijn de laatste jaren nieuwe interacties bekend geworden. Bepalen welke eiwitten met elkaar wisselwerkingen aangaan is een belangrijke methode om de functie ervan te achterhalen. Dit proteomics-gebied is echter zo nieuw, dat mogelijke problemen en artefacten in de methoden nog geen gemeengoed zijn. Hoe betrouwbaar zijn die door high throughput-methoden verkregen resultaten eigenlijk? ‘Daar praat niemand graag over’, zegt dr. Frank Holstege van het Genomics Lab van het UMC Utrecht.

In een artikel in het tijdschrift Molecular Cell (met een Impact Factor van 18, Science : 25), waarvan Holstege als groepsleider laatste auteur is, presenteren bioinformaticus Patrick Kemmeren en collega’s een manier om van enorme datasets met eiwit-eiwit-interacties de betrouwbaarheid te bepalen. En passant geven de onderzoekers voor driehonderd gist-genen een betrouwbare functie-voorspelling.

Het uitgangspunt voor de Utrechters is het sinds vijf jaar bekende gistgenoom. Dat bestaat uit twaalf miljoen baseparen waar iets meer dan zesduizend genen op liggen. In het artikel koppelen de onderzoekers de interactie-datasets van gist-eiwitten aan informatie verkregen via microarrays of DNA-chips.

De truc is dat de genen van eiwitten die ‘bij elkaar horen’ vaak ook tegelijk tot expressie komen en op dezelfde manier gereguleerd worden. Daar kwamen de onderzoekers achter door micro-array-informatie van zeshonderd expressieprofielen onder diverse omstandigheden te analyseren. Zoals de fasen van de celdeling en verschillende vormen van stress. Ze vergeleken vervolgens bekende eiwit-interacties met de mRNA-expressie-patronen. Het bleek dat bij driekwart van de ‘bij elkaar horende’ eiwitten de regulatiepatronen van de genen grotendeels overeenkomen.

Met dat gegeven konden de onderzoekers datasets met onbekende interacties te lijf. Holstege verwachtte dat daar veel fouten in zouden zitten. Dat ligt aan de methode. Een bekende manier om eiwit-eiwit-interacties te bepalen is het two-hybrid assay. Daarbij wordt van twee eiwitten kunstmatig de expressie enorm verhoogd. ‘Als je dan een lichte interactie meet, zou dat al kunnen komen door toevallige elektrostatische aantrekkingskracht. Terwijl die eiwitten elkaar in het echt nooit tegenkomen’, legt Holstege uit. ‘Het levert dus veel vals positieven op. Bovendien veroorzaken de high throughput-methoden door hun snelheid nu eenmaal meer fouten.’

Interacties kloppen niet

Dat blijkt. In het artikel analyseren Holstege en collega’s verschillende datasets met in totaal zo’n negenduizend onbekende eiwit-eiwit-interacties. ‘Van de ene dataset blijken de interacties bijna allemaal te kloppen, terwijl van een andere ongeveer tweederde niet waar is’, zegt Holstege. ‘Maar het mooie van onze methode is dat we die kloppende interacties er uit kunnen halen en daarmee verder kunnen gaan.’

‘Verdergaan’ betekent hier het achterhalen van de functie. Want daar ligt nog veel werk. Holstege schetst de toestand van het gist-genoom.

‘Van het best bestudeerde eukaryote organisme is eenderde van de zesduizend genen goed gekarakteriseerd, bij eenderde hebben we een vage aanwijzing over de functie en van het resterende deel weten we niets.’ Via de analyse-methode van Holstege is het makkelijk om van onbekende genen op een betrouwbare manier de functie te voorspellen. Als twee eiwitten met elkaar interacteren dan ligt het voor de hand dat ze betrokken zijn bij hetzelfde proces. En als van zo’n eiwit-paar één partner bekend is en betrokken is bij de celdeling of bij hittetolerantie dan zal het onbekende eiwit daar ook wel iets mee van doen hebben.

In het artikel voorspellen de onderzoekers op die manier voor driehonderd genen de functie. Om de betrouwbaarheid van die voorspelling te controleren, legden de onderzoekers vijf ervan, met genen waarvan menselijke homologen bestaan, nader onder de loep.

Zo is het gisteiwit NTH1 is nodig voor het herstel na een heat shock. Zijn onbekende partner is het product van het gen Ylr270w (eigenlijk een nog niet karakteriseerd gen, een open reading frame). Heeft dat ook te maken met bescherming tegen de hitte? Een gistcel die het gen mis blijkt inderdaad niet meer tegen hitte te kunnen.

Nog een voorbeeld. Het Map Kinase 1-eiwit is betrokken bij het in stand houden van de celwand. Het onbekende Ylr350w-eiwit interacteert met MPK1. Doet het ook hetzelfde? Deletie van het Ylr350-gen verzwakt inderdaad de celwand van gist.

Goudmijn

Dit zijn twee van de vijf getoetste voorbeelden uit het artikel, maar Holstege zou de lijst naar believen kunnen uitbreiden. ‘Deze analyse is absoluut een goudmijn voor het achterhalen van genfuncties.’ Dat geldt ook voor de mens, benadrukt Holstege, maar van gist is genoeg bekend om dit onderzoek te kunnen doen.

Maar dat resultaat vindt Holstege niet het belangrijkst. Hij is vooral trots op de succesvolle combinatie van bioinformatica met ‘nat’ laboratoriumwerk. De correlatie tussen de duizenden eiwit-interacties met de patronen in de mRNA-expressie-profielen én de statistische toetsing daarvan, vergt veel typisch ‘bioinformatica’ rekenwerk. Drie bioinformatici, een statisticus en drie moleculaire biologen zijn dan ook mede-autaurs van het artikel. Subsidie van het NWO-programma Biomoleculaire Informatica maakte het onderzoek mogelijk.

Holstege: ‘Ik ken geen voorbeelden waar dit soort voorspellingen van genfuncties dankzij informatie anders dan de DNA-volgorde, zo veel concrete resultaten heeft opgeleverd. Dat is vooral te danken aan de combinatie van disciplines.’

Bronnen:

Kemmeren et al. Protein interaction verification and functional annotation by integrated analysis of genome-scale data. Molecular Cell (2002), volume 9, 1133-1143.