Je leest:

Speuren naar The Unculturables

Speuren naar The Unculturables

Auteur: | 7 mei 2005

Metagenomics, het onderzoeken van genen van een complete bacteriële gemeenschap, valt of staat met de zoekstrategie. ‘De meest efficiënte methode moet zich nog bewijzen.’

Een grammetje aarde bevat al snel duizenden soorten bacteriën. De eigenschappen van die micro-organismen zijn in de meeste gevallen volstrekt duister, op een na: ze weigeren in het laboratorium te groeien. Met de gebruikelijke kweekmethoden lukt het afhankelijk van de plaats van herkomst – land, zee of ondergronds – om tussen de 0,1 en 1 procent van het aantal bacteriesoorten in kweek te brengen. Naar de overige 99 procent kunnen onderzoekers slechts gissen wat ze zijn en doen. Met name op het gebied van nieuwe enzymen voor industriële biotechnologie valt er waarschijnlijk nog veel te ontdekken.

Maar al zijn de bacteriën zelf misschien niet te kweken, het DNA dat ze bevatten is wel te onderzoeken. Die activiteit staat volop in de belangstelling, ook van biotechbedrijven als Diversa in de Verenigde Staten. Simpel gesteld komt het onderzoek er op neer dat het DNA van een complete bacteriegemeenschap wordt geïsoleerd. Het DNA dat uit die bacteriecellen komt, kloneert men in plasmiden, die vervolgens in een gemakkelijk te kweken soort als E.coli tot expressie worden gebracht. Zo’n genenbank, met honderdduizenden E.coli’s met verschillende plasmiden wordt een metagenoom genoemd.

Het maken van een collectie genoomsnippers van een complete bacteriële gemeenschap is evenwel niet eenvoudig, zegt de Groningse hoogleraar biotechnologie Dick Janssen. ‘Het DNA is vaak vervuild met humuszuren en er zit veel eukaryoot DNA bij van protozoën en schimmels. Vandaar dat zuiveringsstappen worden toegepast om de bacteriën eerst te scheiden van gronddeeltjes, zonder dat dit grote gevolgen heeft voor de bacteriële diversiteit.’

Sargasso

De ideeën over het maken en screenen van genoombanken zijn volgens Janssen nog volop in beweging. Dr. Esther Gabor deed bij Janssen een promotie-onderzoek, ze berekende onder meer de minimale grootte van de genenbanken. Janssen: ‘Als je ervoor wilt zorgen dat alle genen van de dominante organismen in een monster in de metagenoombank terechtkomen, kom je als snel op honderduizenden verschillende plasmiden. Wie werkt met materiaal waarin de diversiteit erg groot is, en toch ook zeldzame genen wil oppikken moet enorm grote banken screenen. Anders onderzoek je alleen de bacteriesoorten die toevallig erg talrijk zijn.’

Het screenen van een metagenoom begint vaak met de wens om een nieuwe variant van een al bekende enzymactiviteit te vinden. Er staan de onderzoeker dan een paar strategieën ter beschikking: direct onderzoek van het DNA of het zoeken naar bacteriën die de gewenste enzymactiviteit produceren.

De eerste methode wordt toegepast door onder meer Craig Venter. Hij bracht het DNA in kaart van micro-organismen uit water uit de Sargassozee. Resultaat: 1,2 miljoen nieuwe genen. De informatie die uit zo’n database met DNA-sequenties te halen valt, is beperkt doordat allen vergeleken wordt met wat al bekend is. Als onbekende enzymen in de database te weinig lijken op eerder beschreven enzymen, dan zal een alleen een screening op sequenties veel potentieel interessante genen missen. Janssen: ‘Het is een fantastisch project dat veel informatie geeft over de microbiologie van een ecosysteem. Maar aan de hand van een sequentie kun je helaas nog weinig zeggen over de enzymactiviteit en substraatspecificiteit. Daarom test men liever direct op de gewenste enzymactiviteiten.’

Met deze tweede methode, het meten van enzymactiviteiten, kan wel direct gezocht worden naar interessante enzymen. Zo’n screening moet wel aan een belangrijke voorwaarde voldoen. Het gezochte gen moet na expressie een meetbaar of zichtbaar fenotype opleveren om op te selecteren, zoals een kleurreactie, een resistentie, groeiremming of juist het vermogen om op een exotisch substraat te groeien waar E. coli normaalgesproken niet mee uit de voeten kan.

In Janssens lab is op die manier een nieuw penicilline-acylase gevonden uit een grond metagenoombank. Penicilline-acylases worden gebruikt bij de productie van antibiotica en het nieuwe enzym presteerde in veel opzichten beter dan verwante enzymen.

Grondwater

Recent is er een derde screeningsmethode bijgekomen om metagenomen te doorzoeken. Japanse onderzoekers tonen in Nature Biotechnology (23 (1): 88) dat kennis van DNA of enzymactiviteit niet altijd noodzakelijk is om interessante genen op te sporen. De methode gaat ervan uit dat de expressie van veel bacteriële genen direct wordt beinvloed door de stoffen waarop de overeenkomstige enzymen aangrijpen. Een bekend voorbeeld is het lac-operon in E.coli. De productie van het enzym beta-galactosidase, dat lactose afbreekt tot glucose en galactose, wordt gestart zodra lactose de cel binnenkomt en en de promotorregio van het lac-operon beïnvloedt.

Met die gedachte kloneerden de Japanners DNA-fragmenten in plasmides met een GFP-gen, dat codeert voor een groen fluorescerend eiwit. De onderzoekers zochten genen die coderen voor de afbraak van fenol en naftaleen uit een metagenoom van bacteriesoorten uit grondwater van een olie-opslagplaats. De coli’s werden in een medium met een spoortje van deze stoffen gekweekt. Als een plasmide een DNA-sequentie (bijvoorbeeld een promotorelement) bevat die op fenol of naftaleen reageert, dan komt het GFP-gen tot expressie. Die fluorescente kleuring wordt gebruikt voor een geautomatiseerde selectie met een cell sorter (zie illustratie). In korte tijd werden zo 64 interessante genfragmenten uit een bank van 152.000 exemplaren gevist.

Deze substrate-induced gene expression screening (SIGEX) maakt grotendeels geautomatiseerde screening van metagenomen mogelijk. Toch erkennen de onderzoekers dat ook deze methode nadelen heeft. De afleescodes van het DNA-fragment moet wel herkend worden door de genexpressiemachinerie van E.coli. Net als bij software moeten genfragment en gastheer compatibel zijn. Is dat niet het geval dan wordt er geen fluorescent eiwit gevormd. Zestig procent van de genen die Japanners isoleerden had grote overeenkomst met genen van de aan E.coli verwante proteobacteriën.

De genoombank wordt gescreend door de bacterien te kweken in een medium met een substraat voor het enzym waarnaar men op zoek is. Als in DNA-fragmenten promotorelementen zitten die reageren op de inductor gaan de bacterien groen fluoresceren, waarna de cellen automatisch kunnen worden geselecteerd. © Sebastiaan Donders. http://www.fallen-serenity.com.

Klik op de afbeelding voor een grotere versie

Genfragmenten afkomstig van bacteriën die evolutionair ver van E.coli afstaan, worden veel minder efficiënt afgelezen, bemerkten de onderzoekers. Een oplossing is het gebruik van een andere bacteriesoorten, zoals B. subtilis om hetzelfde metagenoom te doorzoeken. De nieuwe screeningsmethode maakt het screenen minder tijdrovend, maar er is gelijk al meer werk voor in de plaats gekomen. Janssen: ‘Op dit moment heeft het metagenomics onderzoek nog weinig standaardprotocollen. De meest efficiënte methode moet zich nog bewijzen en hangt ook af van waar je naar op zoek bent. In ieder geval kan je met metagenomics wel veel sneller nieuwe enzymen vinden. In de looptijd van haar promotie-onderzoek vond Esther Gabor een nieuw penicilline-acylase, dat ze bovendien met gerichte mutaties nog sterk konden verbeteren. Voorheen zou dat vele jaren extra in beslag hebben genomen.’

Meer weten over biotechnologie?

Dit artikel is een publicatie van Bionieuws.
© Bionieuws, alle rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 07 mei 2005

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.