Je leest:

Puzzelen met genoom-stellages

Puzzelen met genoom-stellages

Auteur: | 3 maart 2001

Om de volgorde van bijna drie miljard menselijke baseparen op te helderen, gebruikte Celera de shotgun-methode. Bij deze techniek reconstrueren computers het DNA als een legpuzzel.

Celera-onderzoekers isoleren van vijf proefpersonen DNA. Om te beginnen hakken de genoomjagers het DNA in mootjes van een paar duizend baseparen. Dat kan door het kapot te trillen met ultrageluid of door de keten onder druk door een kleine opening te persen. Vervolgens worden de DNA fragmenten gesorteerd op grootte en ingebracht in het erfelijk materiaal van een bacterie. Deze vermenigvuldigt zich, zo wordt het menselijke DNA gekloond. Daarna start het sequencen van de ingebrachte DNA-fragmenten.

In de dubbelloops shotgun methode begint het sequencen van een fragment aan beide zijden (zie stap 1). Slechts de eerste vijfhonderd baseparen kunnen succesvol gesequenced worden, zo ontstaan van een fragment twee korte DNA stukken (die heten reads). De shotgun methode is statistisch zo uitgedacht dat alle reads samen meerdere malen het genoom bedekken. Een computer kan vervolgens de stukjes bij elkaar puzzelen omdat ze gedeeltelijk overlappen (zie stap 2).

Puzzelstukken

De overlapping is niet zo ideaal dat de hele genoompuzzel in een keer compleet is. Na tienduizenden computeruren hebben de Celera-computers, ruim 27 miljoen reads aan elkaar gekoppeld tot grotere puzzelstukken (zie figuur). Alle reads die samen een ononderbroken stuk genoom vormen, heten een contig (verkorting van contiguous, aangrenzend).

Dan zijn er nog drie problemen. Ten eerste zitten tussen de contigs nog gaten, stukken onbekend DNA. Daarnaast is van verschillende contigs niet meteen duidelijke hoe ze ten opzicht van elkaar in het genoom horen. DNA kan in twee richtingen gelezen worden, per slot van zake. Bovendien is het de vraag waar de contigs op het genoom liggen. Met andere woorden, zowel de positie als de oriëntatie van de contigs zijn onbekend.

Hier brengt de dubbelloops-methode uitkomst. De puzzelstukjes, de reads, horen twee aan twee bijelkaar. Elk paar reads is immers van hetzelfde mootje DNA gesequenced, elke read van een kant. Stel nu dat in het eerste contig een read naar ‘links’ loopt, dan zal in het naburige contig het broertje van de read naar ‘rechts’ lopen. Zo zijn de contigs in een groot aantal gevallen ten opzichte van elkaar te ordenen (zie stap 3). Zo’n ordening van contigs heet een stellage. Celera berekende dat 90 procent van het genoom gedekt was door stellages groter dan 100.000 baseparen.

Als in twee contigs broertjes zitten, dan is ook duidelijk dat de contigs in de buurt van elkaar liggen. De broertjes komen immers uit hetzelfde DNA-fragment. De afstand tussen de broertjes op het genoom is dan ongeveer gelijk aan de – bekende – grootte van het DNA fragment waarvan het koppel het begin en het einde is. Omdat twee contigs vaak meerdere paren reads delen, is de afstand tussen twee contigs met redelijke zekerheid te schatten.

Dubbelloops shotgun methode © Frank Bierkenz Klik op de afbeelding voor een vergroting

Spiekcen

Maar dan zijn de onderzoekers er nog niet, deze ordening van contigs in een stellage is namelijk nog maar relatief. Ok, contig A ligt naast contig B, maar waar – fysiek – liggen deze contigs op het chromosoom? Om dat te bepalen, gebruiken de onderzoekers markers op het genoom. Van sommige stukken DNA is, onder andere door kruisingsexperimenten (bij planten), precies bekend wat de afstand is tot het centromeer, het midden van het chromosoom. Als zo’n marker in een stellage zit, dan is dus bekend waar de stellage op het chromosoom hoort (zie stap 4).

Celera zette de puntjes op de i door de onbekende DNA-volgorde tussen de contigs te dichten via een – relatief omslachtige – PCR-reactie. Uiteindelijk is de genoomkaart van Craig Venter en de zijnen completer dan die van het publieke project. Dat dankt Celera aan het feit dat de informatie van de concurrerende wetenschappers openbaar was, daardoor kon het bedrijf haar DNA-volgorde vergelijken met de publieke. Door eenvoudig spieken heeft Celera dus haar genoomkaart geperfectioneerd.

Dit artikel is een publicatie van Bionieuws.
© Bionieuws, alle rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 03 maart 2001

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.