Dat het felle laserlicht van de microscoop zo’n bepalende factor was voor het maken van een afbeelding van een levende cel, was nog helemaal niet bekend toen Erik Manders in de jaren negentig als postdoc in Oxford begon. Hij wilde bekijken hoe chromosomen, die erfelijke materiaal bevatten, zich binnen de celkern bewegen tijdens de celdeling. ‘Het was bekend dat elk chromosoom in een eigen territorium binnen de cel ligt’ zegt Manders. ‘Maar hoe het chromosoom precies is opgevouwen binnen zo’n territorium, wist niemand. Ik wist dat ik achter de vouwing van chromosomen zou kunnen komen als ik ze zou kunnen filmen tijdens de celdeling. ’

Fotoschade

‘Voor dat filmen gebruikte ik een confocale microscoop waarmee je drie-dimensionale beelden kunt maken. Hoe je dat het beste kon doen, was niet bekend; bijna niemand deed live cell imaging in die tijd. Ik zette de microscoop aan en wachtte, maar er gebeurde niks. De cel ging niet door mitose (celdeling) terwijl alle andere cellen in het preparaat wel door mitose gingen, alleen die ene waar ik naar keek niet. En het bleef maar misgaan.’

‘Eerst dacht ik dat ik gewoon steeds pech had, maar later kwam ik er achter dat ik door het kijken naar de cel de celdeling stopte; het licht waarmee ik naar de cel keek had een toxisch effect. Ik ging de hoeveelheid licht verminderen, verminderen en verminderen. Het moest lukken. Elke nacht liep ik balend naar huis. Maar op een nacht lukte het! Toen had ik een cel waarbij ik het delingsproces kon volgen. Ik had mijn film en ik kon daarmee eindelijk beschrijven hoe het chromosoom is opgevouwen. De conclusie was dat het DNA keurig netjes en ordelijk in de celkern opgeslagen ligt. Maar dat moet ook wel met 2 meter DNA in een kern van 10 micrometer. Vergelijk het maar eens met 10 km vliegertouw in een tennisbal. Als dat niet netjes is opgerold, wordt het een rommeltje.’

Confocale microscoop

Door een normale microscoop zie je een gedeelte van een object scherp afgebeeld, maar het gedeelte van het preparaat dat niet in focus is zie je als een wazige achtergrond. Door een optische truc beeldt een confocale microscoop alleen af wat in focus is. In een confocale micrsocoop scant een laserbundel door het fluorescerende preparaat heen. Door het focus door het preparaat te bewegen en steeds nauwkeurig de hoeveelheid opgevangen licht te registreren wordt een driedimensionale afbeelding van het preparaat gemaakt. Door dit 3D-scannen elke paar minuten te herhalen ontstaat er een driedimensionale film (4D-imaging van levende cellen).

De confocale microscoop werd al bedacht in 1961 door Marvin Minski. Maar omdat er toen nog nauwelijks lasers of computers bestonden, kon de microscoop nog niet gemaakt worden. De confocale microscoop werd uiteindelijk in 1979 voor het eerst gebouwd door professor Brakenhoff (ook werkzaam aan het CAM).

Signaal-ruis

Later ging Manders naar de groep van Dorus Gadella, waar geavanceerde microscopische technieken worden gebruikt voor het bestuderen van levende cellen. Daar bleef hij zoeken naar manieren om de hoeveelheid licht zoveel mogelijk te beperken. De fotonen (lichtdeeltjes) van de laser slaan de fluorescerende stoffen in de cel aan. Bij deze fluorescentie ontstaan zuurstofradicalen die de cel beschadigen en uiteindelijk zelfs doden. ‘Hoe minder fotonen hoe minder fotoschade, maar dan krijg je wel weer een erg “ruisig” plaatje. Je moet steeds de afweging maken: óf ik heb een plaatje met veel ruis, maar wel van een levende cel, of ik heb een mooi plaatje van een dode cel’, aldus Manders.

Hij wilde dus én een mooi plaatje én een levende cel. Uiteindelijk bedacht hij een nieuwe manier van beeldvorming. ‘Wij zijn erg gewend aan een manier van beeldvorming waarbij elk object met evenveel licht beschenen wordt. Kijk maar eens om je heen. Elk object waar je naar kijkt wordt met ongeveer dezelfde hoeveelheid licht beschenen. Maar deze manier van beeldvorming met uniforme belichting is natuurlijk helemaal niet noodzakelijk. Ik heb de manier van imaging op z’n kop gezet.

Stel, je hebt een heel zwak fluorescerend object en ernaast een heel sterk fluorescerend object. Van het zwakke object ontvang je maar heel weinig fotonen. Dus daar moet je zoveel licht op gooien dat je er voldoende fotonen van terug krijg zodat de signaal-ruisverhouding goed is. Maar op het felle object hoef je lang niet zoveel licht te schijnen om een goede signaal-ruisverhouding te krijgen. En in de achtergrond, tussen de objecten in, heb je helemaal geen licht nodig, want daar is toch niets te zien.’

‘Er zijn dus drie verschillende soorten pixels: de niet-interessante achtergrondpixels, de zwakke voorgrondpixels, die je graag goed wilt zien, en de hele felle voorgrondpixels, die je ook met wat minder licht wel goed kan zien. Dus ik dacht: Als ik nou elk pixel op een aparte manier ga belichten, dan kan ik die signaal-ruisverhouding op mijn eigen manier regelen. Dus eigenlijk ga ik het preparaat heel selectief belichten en heb ik dus maar heel weinig licht nodig om hetzelfde te kunnen zien. Heel stiekem kijken naar cell dus. Supersimpel, maar supereffectief.’

‘Vergelijk het met iemand die inbreekt in een bank op zoek naar de kluis. Een domme inbreker doet al het licht in het hele bankgebouw in één keer aan. Deze inbreker vindt uiteindelijk de informatie die hij zoekt; de kluis, maar zal de schadelijke invloed van al dat licht ondervinden. De slimme inbreker loopt met een zaklantaarn door het gebouw en gebruikt zijn licht heel selectief. Ook hij vindt de kluis, maar met veel minder schadelijke gevolgen van het licht. En zo werkt CLEM.’

Manders bouwde samen met Ron Hoebe en Carel van Oven van het AMC het eerste CLEM-model. Het is een elektronicakastje dat het licht in de pixel meet en het heel snel uitschakelt zodra hij genoeg fotonen heeft ontvangen. Aan de hand van de belichtingstijd en het aantal fotonen dat het kastje meet, berekent CLEM de hoeveelheid fluorescentie.

Twee voorbeelden van CLEM-microscopie

Patent

CLEM werkt. Cellen blijven dankzij de gereduceerde belichting zeven keer langer leven zonder dat de beeldkwaliteit acheruit gaat. Nature Biotechnology plaatste het artikel over CLEM en Manders vroeg een patent aan. Eerst in Nederland, daarna in Japan, Amerika en Europa. Het Japanse bedrijf Nikon produceert CLEM inmiddels en zal het in april op de Europese markt brengen.

‘In vakbladen over microscopie zie ik nu af en toe een advertentie voor CLEM langskomen. Dat is natuurlijk heel leuk’, zegt Manders enthousiast. ‘Bovendien is het aardig om als wetenschapper bij zo’n vercommercialisering betrokken te zijn. Dat gebeurt binnen de UvA veel te weinig als we dat vergelijken met de TU’s of met Amerikaanse universiteiten.’

Manders heeft van NWO een subsidie gekregen om een nieuwe microscoop te kopen. ‘Het is eigenlijk wel grappig dat we onze eigen uitvinding bij Nikon gaan kopen. We willen nu echt een superopstelling hebben voor het bestuderen van levende cellen, met verschillende lasers en alle nieuwste snufjes. Het is prachtig om te zien wat er tegenwoordig allemaal mogelijk is. Door een microscoop zie je iets wat je normaal niet ziet. Als kind keek ik ook al met een microscoop naar waterkevertjes. Je komt in een andere wereld. En hoe meer technologie, hoe meer je van die wereld kunt zien. Steeds meer en meer detail en informatie.’

‘Volgens mij kan CLEM echt belangrijk worden. Over tien jaar zou het best eens zo kunnen zijn dat elke confocale microscoop met CLEM is uitgerust’, voorspelt Manders. Naast het publiceren, patenteren en vercommercialiseren van kennis vindt Manders media-aandacht belangrijk. ‘Die subsidie voor die nieuwe microscoop moeten de belastingbetalers bij elkaar brengen. Dan mogen ze ook wel weten wat we precies met dat geld gaan doen.’