Je leest:

Nieuwe lasertechniek spaart muizen

Nieuwe lasertechniek spaart muizen

Auteur: | 10 februari 2009

Het AMC heeft als eerste in Nederland een lasertechniek in huis gehaald waarmee het sneller genetisch gemodificeerde muizen kan genereren. Bovendien kan de techniek gebruikt worden om muizensperma in eicellen te injecteren.

Het Animal Research Institute AMC (ARIA) heeft als eerste in Nederland een lasertechniek in huis gehaald waarmee het sneller genetisch gemodificeerde muizen kan genereren. Voordelen: er zijn veel minder proefdieren nodig en onderzoekers krijgen hun muis drie maanden eerder.

‘We zeggen altijd: dit is een instelling met twaalfduizend bedden’, vertelt Marian van Roon, terwijl ze een ruimte toont waarin de transgene muizen zijn ondergebracht. De meeste dieren delen een kooi maar elk dier heeft een eigen status waarin het wel en wee van de muis beschreven staat. En zo zijn er nog meer kamers, met in totaal zo’n twaalfduizend proefdieren. Van Roon staat aan het hoofd van de faciliteit voor Genetisch Gemodificeerde Muizen (GGM) van het ARIA, waar onderzoekers terecht kunnen als ze een muis met een bepaalde genetische samenstelling nodig hebben.

Het genereren van zo’n dier is sinds eind jaren tachtig mogelijk. Toen ontwikkelden biologen een techniek om individuele genen in een proefdier aan en uit te zetten. Op die manier kunnen afwijkingen bij de mens in muizen nagebootst worden, zoals aandoeningen die veroorzaakt worden door één defect gen. Maar ook kan bijvoorbeeld onderzocht worden of de aanwezigheid van een bepaald gen invloed heeft op de groei van tumoren. Dergelijk onderzoek heeft inmiddels zo veel kennis opgeleverd, dat de bedenkers van de techniek er eind vorig jaar de Nobelprijs voor kregen.

Chimere muis

Arbeidsintensief is het verkrijgen van genetisch gemodificeerde muizen wel. Dat gebeurt met behulp van stamcellen die bij muizenembryo’s zijn weggenomen en waarin de genetische verandering is aangebracht. Deze stamcellen zijn ongedifferentieerd, wat wil zeggen dat ze nog van alles kunnen worden: bot-, spier-, huid-, levercel, noem maar op. De gewijzigde stamcellen worden vervolgens in andere embryo’s geïnjecteerd. Daaruit ontstaat een chimere muis, een dier dat zowel gewijzigde als ‘normale’ stamcellen in zich heeft. Deze muis wordt vervolgens gekruist met een wildtype muis, zeg maar een ‘gewoon’ exemplaar. Een deel van hun nakomelingen zal de modificatie in zich hebben en moet nogmaals gekruist worden. Van de generatie die daar uit voortkomt, is uiteindelijk een kwart geschikt voor proefdieronderzoek.

Op deze manier worden chimere knock-out muizen gemaakt: zwart + beige = bont. In zeer jonge muizenembryo’s brengen we cellen met een uitgeschakeld gen in, om zo de functie van dat gen te achterhalen. De embryo’s waren afkomstig van zwarte muizen, de ingebrachte cellen van beige muizen. De procedure leidt tot muizen die beide cellen dragen. Zij hebben een bonte vacht: hoe lichter de vacht, hoe groter het aandeel van de cellen met het uitgeschakelde gen. Klik op de afbeelding voor een grotere versie

‘Je bent al gauw een half jaar bezig voordat je het gewenste aantal muizen hebt gefokt’, legt Van Roon uit. ‘Ook houd je grote aantallen dieren over die je niet kunt gebruiken. Daarom willen we graag de chimere fase overslaan. Dat kan door de embryonale stamcellen in een vroeger ontwikkelingsstadium van het embryo te injecteren.’ Normaal wachten onderzoekers tot een embryo het stadium van blastocyst heeft bereikt. De cellen hebben zich dan al enkele keren gedeeld en er ontstaat een holte. In die ruimte kunnen de gemodificeerde stamcellen op een veilige manier geïnjecteerd worden, zonder dat de scherpe naald de cellen van het embryo beschadigt.

Van Roon: ‘Amerikaanse onderzoekers ontdekten dat het veel beter is om in een eerdere fase van de ontwikkeling stamcellen in te brengen. Als het embryo in het achtcellig stadium verkeert, of zelfs nog maar in een viercellig stadium. Dan krijg je een muis met alleen maar gewijzigde cellen en zijn al die kruisingen niet nodig. Dat kan wel drie maanden en een hele generatie muizen schelen.’

Hoe dat komt? De embryonale stamcellen die bij een achtcellig embryo worden ingebracht, zijn ouder dan dat embryo. Ze lopen als het ware voor op de gastheercellen. Daardoor gaan de gemodificeerde cellen alvast door met de verdere vorming van het embryo, terwijl de al aanwezige gastheercellen achter de feiten aanlopen en zich alleen nog maar kunnen transformeren tot de vliezen om het embryo heen. Dat is in het blastocyst-stadium anders: dan gaat de ontwikkeling van beide soorten stamcellen gelijk op en slaan niet alle gewijzigde exemplaren aan.

Door stamcellen in te brengen bij een acht-cellig embryo kun je het chimere stadium overslaan. Dat komt doordat in dat geval de stamcellen in hun ontwikkeling voorlopen op de gastheercellen.

Er zat echter één praktisch probleem vast aan het idee van de Amerikanen: het is een heidens karwei om een achtcellig embryo te injecteren. De cellen liggen in een soort zakje, de zona pellucida, dicht tegen elkaar aan geplakt, waardoor het risico levensgroot is dat je ze met de naald beschadigt. ‘Daarom is er een lasertechniek ontwikkeld. Met zo’n laser kun je uiterst precies te werk gaan. Je brandt een gaatje in de zona pellucida, waarna je de stamcellen op een veilige manier met een stompere naald kunt inbrengen’, legt Van Roon uit.

Vuilnisbakkenrassen

De techniek mag onderzoekers dan wel tijdwinst opleveren, voor analist Nanda van Eeken is tijd de grootste vijand. Ze heeft tussen de vier en zes uur om zo veel mogelijk embryo’s in het achtcellig stadium te voorzien van genetisch gewijzigde stamcellen. Daarna delen de embryo’s zich verder en is de kans op een muis die alleen maar van gemodificeerde stamcellen afkomstig is, verkeken. ‘Ik kan er zo’n tachtig tot honderd injecteren. Het is zaak dat ik de zich wat sneller ontwikkelende embryo’s, die ‘s nachts al viercellig worden, als eerste neem, anders red ik het niet.’

Gelukkig hoeft ze daarvoor niet op de meest waanzinnige tijdstippen in het lab te zijn. Muizen hebben namelijk een vast ritme, ook wat het paren betreft. ‘Dat gebeurt altijd in het donker, dus houden we een strikt dag/nacht ritme aan. Dan kunnen we tijdens de kantooruren de bevruchte eicellen wegnemen en het embryo in een vroeg stadium injecteren met genetisch gewijzigde stamcellen’, zegt Van Roon.

Al vrij kort na de geboorte van de pups weten de onderzoekers of ze het veranderde genetisch materiaal in voldoende mate in zich hebben. Daarvoor bestaat een eenvoudige methode: ze nemen het embryo van een witte muis en injecteren deze met de embryonale stamcellen van een zwart exemplaar. Als er een zwartwitte pup geboren wordt, is deze chimeer. Hoe zwarter de muis, hoe meer gewijzigde stamcellen deze bevat. Met de lasertechniek zou deze truc niet meer toegepast hoeven worden; alle muizen zouden immers volledig zwart zijn. Maar zo simpel is het niet, stelt Van Roon. De laser vergemakkelijkt het injecteren, of het lukt is afhankelijk van andere factoren. ‘We zijn nu bijna een jaar bezig met de nieuwe methode, maar het is ons nog niet gelukt om zonder verdere kruisingen een volledig genetisch gewijzigde muis te genereren. Wel krijgen we veel betere chimeren, en dat scheelt al heel wat tijd en proefdieren.’

Dat de muizen met de nieuwe methode nog steeds chimeer zijn, ligt aan de kwaliteit van de embryonale stamcellen. Daarom laat Van Roon vanuit de VS stamcellen aanrukken met meer potentie. ‘Normaal gezien komen deze cellen uit embryo’s van inteelt-muizen’, licht Van Roon toe. ‘Maar die blijken minder “sterk”. Daarom gaan we werken met stamcellen van muizen die niet raszuiver zijn, zeg maar van vuilnisbakkenrassen.’

Komma

Overigens heeft het ARIA – en met name analist John Spijkers – nog meer plannen met de nieuwe laser. Zo zou deze ingezet kunnen worden voor ICSI (Intra Cytoplasmatische Sperma Injectie), ofwel de injectie van muizensperma in eicellen. ‘Onderzoekers willen graag een muizenlijn bewaren als de proeven zijn afgerond. Zodat ze snel over een genetisch gemodificeerde muis kunnen beschikken voor bijvoorbeeld vervolgonderzoek, en ze niet dat hele proces van genereren opnieuw moeten doorlopen. Daarom worden er embryo’s ingevroren’, legt van Roon uit.

‘Maar ideaal is dat niet. Een embryo is er nog altijd maar één, hè? Bovendien is het verzamelen van de benodigde embryo’s arbeidsintensief. Je moet uitgebreid gaan fokken om ze te verkrijgen, terwijl je nog niet weet of je ze ooit gaat gebruiken. Daarom kun je beter muizensperma invriezen. Uit een kleine hoeveelheid kun je tienduizenden nakomelingen verkrijgen.’

Zaadcellen in muizensperma hebben de vorm van een komma. Daarom is het goedje ook niet makkelijk in te vriezen. De staart breekt bij het bevriezen snel af.

Muizensperma laat zich echter tot nu toe niet goed invriezen. Dat heeft met de vorm van de zaadcellen te maken – die zien eruit als een komma. Daardoor breekt tijdens het ontdooien al snel dat deel af dat ervoor zorgt dat de zaadcel de eicel kan binnendringen. Van Roon: ‘Een knelpunt dat we willen omzeilen door andere methodes van invriezen te gebruiken. Als dat lukt, kunnen we overgaan tot IVF. Blijft de kwaliteit slecht, dan kiezen we voor ICSI, waarbij de laser het gaatje in de eicelwand maakt zodat de zaadcel geïnjecteerd kan worden.’

Allemaal goed nieuws dus voor onderzoekers die met muizenmodellen werken. Toch zag de GGM-faciliteit de vraag naar nieuwe transgene muizen afnemen. Dat heeft alles te maken met de Nederlandse wetgeving. Volgens het Besluit Biotechnologie bij Dieren (BBD) moet je voor ieder onderzoek waarvoor transgene muizen nodig zijn, een vergunning aanvragen. Deze procedure kent een publieke fase, waarbij iedere Nederlander protest kan aantekenen. Van Roon: ‘Dat kost veel tijd. En eigenlijk is het zinloos geworden, want tot nu toe zijn altijd dezelfde argumenten gebruikt door degenen die bezwaar maakten en die worden steeds verworpen. Maar daardoor laten onderzoekers hun muizen liever in het buitenland maken, zodat ze het Besluit omzeilen. Die dieren moeten hier vervolgens in quarantaine – omdat we ongewenste ziektekiemen buiten de deur willen houden – waarna hun embryo’s in “lokale” draagmoeders geïmplanteerd worden.’

Het ziet er echter naar uit dat de wet gaat veranderen, want een aantal kamerleden vindt dat het klimaat voor onderzoekers werkzaam moet blijven. Er is nu voorgesteld om de openbare procedure over te slaan en het onderzoeksvoorstel te laten beoordelen door Dier Experimenten Commissies. ‘Wij hopen dat door die versoepeling straks weer meer onderzoeksvragen onze kant op komen’, zegt Van Roon. ‘Anders hebben we niks aan die nieuwe laser.’

Zie ook:

Dit artikel is een publicatie van AMC Magazine.
© AMC Magazine, alle rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 10 februari 2009

NEMO Kennislink Agenda

NEMO Kennislink vertoont op deze plaats normaal gesproken wetenschappelijke activiteiten uit heel Nederland. Door de maatregelen tegen het nieuwe coronavirus zal daarvan een groot gedeelte worden afgelast. Omdat we geen achterhaalde informatie willen verspreiden, laten we voorlopig geen activiteiten zien.
NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.