Je leest:

Mutanten als hulpmiddel in onderzoek naar kieming van zaden

Mutanten als hulpmiddel in onderzoek naar kieming van zaden

Auteur: | 7 mei 2002

Mutanten zijn een belangrijk hulpmiddel in wetenschappelijk onderzoek, en dus ook in de plantenfysiologie. Via een mutatie kun je de functie van een gen uitschakelen. Door een veranderd fenotype herken je de mutant en kun je de rol bestuderen die het gen speelt in de plant.

Mutanten zijn organismen met een wijziging (mutatie) in hun genetische samenstelling. Een mutatie kan leiden tot een organisme met andere eigenschappen dan hun ouders. Mutanten worden daarom gebruikt bij het bestuderen van de functie van genen. Onderzoekers hebben diverse methoden ontwikkeld om mutanten te maken. Het vinden van de mutant waar je naar op zoek bent is echter niet makkelijk. Daar moet je heel wat moeite voor doen.

Het nut van mutanten

Sinds jaar en dag worden mutanten gebruikt in biologisch onderzoek. Zo ook in onderzoek naar kiemgedrag van zaden. Diverse mutanten zijn beschreven waarvan het kiemingsgedrag gewijzigd is ten opzichte van dat van het wild-type, dat het originele kiemingsgedrag vertoont. Zo’n mutant vertelt je daarmee hoe belangrijk het gemuteerde gen is voor kieming. Er zijn mutanten beschreven die eindeloos in kiemrust (dormantie) blijven, tenzij je het hormoon gibberellinezuur toevoegt dat kieming stimuleert. Deze mutanten blijken, zoals te verwachten valt, een gewijzigd gen te bezitten dat normaal codeert voor een enzym dat betrokken is bij de productie van gibberellinezuur, een hormoon dat een sleutelrol speelt tijdens kieming. De mutanten hebben daardoor een laag gibberelline-gehalte, wat leidt tot het waargenomen fenotype: dormantie.

Daarnaast zijn er ook mutanten beschreven die juist géén dormantie kennen en snel kiemen. Dit zijn mutanten die onvoldoende abscisinezuur kunnen produceren, een hormoon dat een belangrijke rol speelt bij de inductie van kiemrust. De mutaties blijken opnieuw te zijn opgetreden in genen coderend voor enzymen, in dit geval enzymen betrokken bij de productie van het hormoon abscisinezuur. Dit onderzoek bevestigt wat al langer werd vermoed: de twee genoemde hormonen spelen een antagonistische (tegengestelde) rol in kieming en dormantie.

Een speld in een hooiberg

Hoe verkrijg je mutanten? In de eerste plaats dient vermeld te worden dat mutaties een natuurlijk fenomeen zijn. (Zon)licht kan mutaties teweeg brengen door de UV component. Hoge temperatuur doet het ook. In onderzoek is een ethylmethaansulfonzuur (EMS) behandeling een veelgebruikte methode om mutanten te maken. EMS is een chemische verbinding die puntmutaties aanbrengt in het genoom (het totaal en erfelijke informatie dat ligt opgeslagen in een cel). Door de puntmutatie wordt op een willekeurige plek in het genoom een guanine (één van de vier basen in het DNA) veranderd in een adenine, of een thymine in een cytosine. Wanneer zo’n puntmutatie optreedt in een coderend gen, kan dit leiden tot een verandering in de bouw van het eiwit waar het gen voor codeert. Immers, een simpele wijziging van een base kan leiden tot een triplet dat codeert voor een ander aminozuur, en kan gevolgen hebben voor de driedimensionale structuur van het eiwit. Een puntmutatie die er bijvoorbeeld voor zorgt dat een aminozuurcoderend triplet in een stopcodon wordt veranderd, leidt tot een korter eiwit met duidelijke consequenties voor de structuur en functie van dat eiwit.

Met EMS kun je echter niet gericht mutageniseren. EMS veroorzaakt immers mutaties op willekeurige plaatsen in het genoom. Door een heleboel zaden te behandelen met EMS krijg je een populatie van verschillende mutanten. Met een beetje geluk zit daartussen de mutant waar je naar op zoek bent. Het probleem is om die mutant te herkennen. Omdat bovendien de mutatiefrequentie heel laag is (er zijn maar weinig mutanten) moeten duizenden planten worden ‘gescreend’. Daarvoor is het handig om een selectiemethode uit te voeren. Wanneer je denkt aan kiemingsgedrag, dan kan de selectiemethode bestaan uit: zaden die in staat zijn om dormant te blijven en pas kiemen na toevoeging van gibberellinezuur.

Monnikenwerk

Tot zover gaat alles volgens plan, het denkwerk voor het experiment is verricht. Maar nu begint het grote werk. Stel je bent op zoek naar een mutant die niet dormant is, en je zaait 10000 zaden die behandeld zijn met EMS. Je hebt dan nog niet de populatie mutanten! Dat komt omdat een mutatie veelal recessief is, en je een homozygoot nodig hebt om het fenotype (de mutant) te herkennen. De populatie van 10000 zaden waarmee je bent begonnen is echter heterozygoot, de EMS heeft slechts één van de twee DNA strengen gewijzigd. Dus wat doe je? Je kweekt de zaden op tot planten, laat de planten zelfbestuiving verrichten, en test de volgende generatie zaden op de afwezigheid van dormantie en het vermogen om direct te kiemen, terwijl de meerderheid dormant blijft. De recessieve mutant kun je nu zo selecteren. Afbeelding 1 laat zien hoe middels zelfbestuiving de homozygoot recessieve mutant, het niet dormante zaadje, kan worden onderscheiden van de rest.

Afbeelding 1. Schematisch wordt hier de zelfbestuiving van een heterozygoot recessieve mutant weergegeven en het resultaat van genotype naar fenotype. (a) De mutatie (rood stukje DNA) zit maar in 1 van de 2 DNA strengen (b) Genotype van de nakomelingen: homogozygoot dominant, heterozygote en homozygoot recessieve nakomelingen ontstaan in een verhouding 1:2:1 © De recessieve homozygoot (de gezochte mutant), in dit geval een niet-dormant zaadje, is te herkennen aan een ander fenotype .

Dit is makkelijker gezegd dan gedaan. Er zijn talloze problemen die gepaard gaan met dit experiment. In de eerste plaats moeten planten makkelijk te kweken zijn. De grote aantallen planten vragen om veel kasruimte, dus ze moeten bij voorkeur klein zijn. De generatietijd moet zo kort mogelijk zijn, want je wilt niet een jaar of nog langer wachten tot de volgende generatie zaden. En de soort moet een zelfbestuiver zijn. En tot slot wil je een soort die geen hoge temperaturen nodig heeft om te groeien, om de kweekkosten in de kas laag te houden. Al deze criteria leidden er zo’n twintig jaar geleden toe dat zandraket, Arabidopsis thaliana, een veelgebruikte soort werd om mutanten te karakteriseren. Intussen gebruikt de meerderheid van de onderzoeksgroepen ter wereld deze soort. Prof. Maarten Koornneef van Wageningen Universiteit heeft daar in belangrijke mate toe bijgedragen, want hij was een van de eersten die inzag dat Arabidopsis thaliana een nuttig onderzoeksobject was. Dat anderen het met hem eens zijn mag blijken uit de toename van het aantal wetenschappelijke publicaties met Arabidopsis thaliana als onderwerp. Een snelle zoektocht in een database met wetenschappelijke publicaties laat een toename zien in 20 jaar tijd met een factor 193. Vergelijk dit met een groei van een factor 2 tot 4 voor gangbare gewassen als kool en tomaat. De cijfers spreken boekdelen.

Het moge duidelijk zijn dat de meeste van die wetenschappelijk publicaties over genetisch onderzoek gaan. Arabidopsis thaliana mag men dan ook beschouwen als de fruitvlieg onder de planten (zie afbeelding 2). De grote populariteit van Arabidopsis thaliana heeft er tevens toe geleid dat dit de eerste plantensoort is waarvan het complete genoom gesequenst is (de volgorde van de basen is in kaart gebracht). Deze schat aan informatie is toegankelijk op het internet, en stelt anderen in staat om verder genetisch of moleculair onderzoek uit te voeren.

Afbeelding 2. Arabidopsis thaliana: voor wetenschappers in de plantengenetica is deze soort de fruitvlieg onder de planten.

Onverwachte neveneffecten

Zodra je de homozygote mutant te pakken hebt (in het geval van de abscisine-mutant een niet-dormant zaad) vermeerder je die door de plant op te kweken, zelfbestuiving toe te passen, zaden te oogsten en een volgende generatie planten te kweken. Eén generatie is niet genoeg, want de Arabidopsis plant maakt per plant ‘slechts’ 2000 zaden. Twee generaties zijn nodig om een ruime hoeveelheid zaden te hebben voor verdere experimenten. Bij het opkweken kunnen echter problemen optreden: in het geval van een abscisine-mutant verwelken de bladeren snel en de plant heeft moeite om water vast te houden. Een hoge luchtvochtigheid is vereist om te voorkomen dat de mutatie letaal wordt. Wat blijkt? Het onvermogen om abscisinezuur te produceren heeft ook gevolgen voor andere delen van de levenscyclus. Huidmondjes blijven open staan zonder abscisinezuur, wat de problemen verklaart. Dit soort meervoudige effecten van een mutatie zijn niet ongebruikelijk in de plantenwereld. Zo heeft de gibberelline-mutant, die zonder toevoeging van gibberelline niet kan kiemen, problemen met het strekken van de stengel en de productie van bloemen.

De verscheidenheid in effecten op de plant die door een enkele mutatie in één gen wordt veroorzaakt is groot. Dit doet vermoeden dat het regulatiemechanisme van een plantenhormoon complex is. Het laat tevens het belang zien van mutanten in de wetenschap. Immers, de rol van een gen kan via mutanten goed bestudeerd worden, en deze rol is in sommige gevallen groter dan vermoed.

Dit artikel is een publicatie van Nederlands Instituut voor Biologie (NIBI).
© Nederlands Instituut voor Biologie (NIBI), sommige rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 07 mei 2002

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.