Je leest:

Muizenknock-outs in de versnelling

Muizenknock-outs in de versnelling

Auteur: | 20 juli 2002

Stroomstootjes bij embryo’s kunnen tijd en dieren besparen bij het maken van knock-outmuizen. En wat bij de zebravis kan, gebeurt ook bij muizen: knock-outs door chemicaliën.

Honderdvijftig muizen. Zoveel mag een onderzoeker gebruiken om een gen in een muis uit te schakelen, de bekende knock-out. Met overheidsvergunning kunnen dan drie verschillende lijnen worden gemaakt van dezelfde knock-out, met vijftig dieren per lijn. ‘Dat is gebaseerd op ervaringskennis van de commissie’, zegt mr. drs. Henk Lommers, secretaris van de Commissie Biotechnologie bij Dieren (CBD), die de toetsing van de vergunningaanvragen voor genetische modificatie van dieren uitvoert.

‘Om een knock-out te maken zijn eiceldonoren nodig, dekmannetjes en draagmoeders. Er ontstaan vervolgens chimere muizen en ook niet-gemodificeerde dieren. Als je dat allemaal optelt kom je ongeveer uit op vijftig dieren per lijn, maar het exacte aantal verschilt per muizenstam en onderzoeksgroep. Het is daarom ook moeilijk precies aan te geven hoeveel van de vijftig dieren in elke fase van het experiment worden gebruikt.’

Geen wonder

Het maken van gemodificeerde dieren is inmiddels een standaardprocedure – in 2000 werden 37.530 muizen gebruikt om nieuwe gemodificeerde lijnen te maken, en werden met 89.422 gemodificeerde muizen experimenten verricht.

Toch is het nog steeds geen routinekwestie, die een beginnend onderzoeker even uitvoert. Bij knockouts gaan er in het meest gunstige geval drie muizengeneraties en negen maanden overheen, voordat onderzocht kan worden wat het effect van het uitgeschakelde gen is. Vaak duurt het langer; geen wonder dus dat ontwerpen, maken en onderzoeken van één enkele knockoutmuis een hele promotie in beslag kan nemen.

Die tijd gaat deels zitten in het uitschakelen van het gewenste gen in embryonale stamcellen, en voor een ander belangrijk deel in het opkweken van een complete muis uit die stamcellen. Dat laatste gebeurt door de stamcellen in een muizenembryo te injecteren en het embryo in een draagmoeder te plaatsen. Met wat geluk ontstaat zo een mannelijk dier dat deels wel en deels niet gemodificeerd is: een chimeer. Omdat de stamcellen en het embryo afkomstig zijn van muizenstammen met verschillende vachtkleuren, heeft het chimere dier een bonte vacht (zie illustratie).

Vervolgens wordt er met de chimere muizen een aantal generaties verder gefokt totdat een dier ontstaat dat helemaal afstamt van de gemodificeerde stamcellen en waarbij beide kopieën van het gen zijn uitgeschakeld. Het is dus niet vreemd dat onderzoekers kijken naar snellere wegen om hetzelfde doel te bereiken.

Stroomstoot

De onderzoeksgroep van Rudolf Jaenish beschrijft in Nature Biotechnology (mei 2002) een snellere methode. De eerste aanpassing die Jaenish toepaste is tetraploïde embryocomplementatie, waardoor direct muizen onstaan die volledig afstammen van de gemodificeerde stamcellen. Bij deze al langer bestaande methode worden de stamcellen niet in gewone muizenembryo’s (2n) geïnjecteerd, maar in exemplaren met een dubbel chromosoomaantal (4n). Tetraploïde embryo’s ontstaan door gewone embryo’s met een stroomstoot te behandelen.

Het resultaat is een blastocyst die uitsluitend bijdraagt aan de vorming van de placenta, terwijl het embryo zich ontwikkelt uit de geïnjecteerde stamcellen. Er worden dus geen chimere dieren geboren, maar dieren die in iedere cel gemodificeerd zijn. De tweede aanpassing is sexeselectie op de gemodificeerde stamcellen. Normaal gesproken worden altijd mannelijke (XY) stamcellijnen gemodificeerd, omdat met mannelijke muizen sneller fokresultaten kunnen worden behaald. Maar er moeten wel twee generaties doorgefokt worden voordat de onderzoeker de knock-outdieren kan bestuderen.

Geen gemeengoed

Jaenish beschrijft dat tijdens het kweken circa twee procent van de stamcellen hun Y-chromosoom verliezen. En deze XO-stamcellen ontwikkelen zich na injectie tot vrouwtjesmuizen. Het is dus mogelijk om uit dezelfde gemodificeerde stamcellen zowel vrouwtjes als mannetjes te maken. Er is vervolgens slechts één kruising nodig om de gewenste knock-outmuizen te krijgen.

‘Het is een zeer elegante methode, Jeanish loopt voorop’, zegt prof. dr. Anton Berns, directeur van het Nederlands Kankerinstituut (NKI) en pionier op het gebied van genetische modificatie van proefdieren. ‘Maar wij gebruiken deze methode nog niet. Het is vooral handig als je snel wilt zien wat het effect van een knockout is. Voor ons onderzoek is dat niet zo van belang, omdat we vaak op lange termijn onderzoek verrichten met knock-outs – een klein beetje tijdwinst maakt dan weinig verschil.’

Volgens Berns is Jeanish’ methode nog geen gemeengoed. Succes van Jaenish’ aanpak hangt namelijk af van de kwaliteit van de gebruikte embryonale stamcellen. Bij veel gebruikte stamcellijnen is het moeilijk om via tetraploïde embryo’s gemodificeerde muizen te maken. Waarschijnlijk heeft dat met imprintig te maken; de expressie van cruciale genen verandert na langdurige kweek van de stamcellen.

Berns: ‘Je moet dan veel tijd gaan steken in onderzoek aan de kwaliteit van de gebruikte stamcellen, en daar kom je eigenlijk alleen achter als je ze daadwerkelijk in een embryo injecteert.’ Het is daarom volgens Berns de vraag of Jaenish’ methode proefdieren kan besparen. Er ontstaan immers minder dieren tijdens het fokken van de knockoutmuizen. Maar als het gebruik van tetraploïde embryo’s inefficiënt is, zijn er juist meer eiceldonoren en draagmoeders nodig, dan in de reguliere experimenten. ’Misschien als alles perfect zou werken, bespaart het proefdieren. Maar daar gaat wel een heel testtraject aan vooraf.

Voorlopig is het een zeer bruikbare methode, maar voor een specifiek segment van het onderzoek.’ Met dezelfde blik kijkt ook de Commissie Biotechnologie bij Dieren ernaar. De ontwikkelingen in het laboratorium zijn maatgevend voor de aantallen dieren die de commissie toewijst. De CBD zal niet op basis van recente methodologische verfijning direct eisen dat iedere onderzoeker die techniek toepast. Lommers: ‘Uiteraard volgen wij deze ontwikkelingen. Pas als het standard use is in de laboratoria, en blijkt dat het een besparing van proefdieren oplevert, zullen de commissieleden het naar verwachting als voorwaarde gaan stellen.’

Bronnen:

Eggan, K. et al (2002) Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nature Biotechnology 20:455-459. Zo doende, 2000. Nature 417 (2002): 785-786.

Dit artikel is een publicatie van Bionieuws.
© Bionieuws, alle rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 20 juli 2002
NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.