Het maken van een knock-out muis kost bloed zweet en tranen. Maar het gebeurt geregeld dat een dier geboren wordt en niets lijkt te mankeren, terwijl een cruciaal geacht gen ontbreekt. ‘Dat is eerder regel dan uitzondering’, zegt NKI-onderzoeker dr. Paul Krimpenfort. ‘Daar hebben we hier in het laboratorium veel voorbeelden van. Bijvoorbeeld knockouts van genen uit de pim-familie, die betrokken zijn bij leukemie in de muis. Knockouts daarvan komen volkomen normaal ter wereld – op het eerste gezicht.’

‘In een cynische bui heb ik me wel eens hardop afgevraagd, waarom muizen DNA hebben, als je het zonder gevolgen toch allemaal kunt uitschakelen’, zegt dr. Huub Schellekens, directeur van de Centrale Proefdierfacilteit van de Universiteit Utrecht. ‘Dat is natuurlijk overdreven – sommige knock-outs sterven al als embryo – maar het algemene beeld is toch dat ze vaak minder dramatische afwijkingen laten zien dan men vooraf verwacht.’

De muis logenstraft de gedachte dat de functie van een gen eenvoudig te achterhalen is door het gen uit te schakelen en het effect op het fenotype te onderzoeken. Daar zijn verschillende verklaringen voor, weet Krimpenfort. ‘Bij de pim-genen is sprake van een genfamilie, die de functie van het ontbrekende gen kan overnemen.’ Zogenaamde redundantie – overlappende genfunctie – versluiert het effect van de knock-out. Een mogelijkheid is dan om verschillende knock-outs met elkaar te kruisen. Maar dat is geen garantie voor succes. ‘Van een andere genfamilie hebben we een drievoudige knock-out gemaakt, maar daar was aan het fenotype nog steeds niets te zien.’

Bloedcellen

Een andere verklaring voor het ontbreken van duidelijk fenotype is volgens Krimpenfort dat de dieren niet onder de juiste omstandigheden worden gehouden. Het fenotype ontstaat immers in interactie tussen genotype en milieu, en aanpassingen daarin leiden soms wel tot resultaat. Als sommige pim knockout muizen worden blootgesteld aan infecties dan zijn er wel duidelijke effecten te zien. ‘Dat zijn ingewikkelde analyses, maar door naar verschillende stappen in de immuunrespons te kijken hebben we voor pim een beter beeld gekregen; het is betrokken bij de acute respons op allerlei stimuli.’

Schellekens: ‘De analyse wordt ook steeds belangrijker: het histologisch en cytologisch onderzoek, om effecten van knock-outs te zien.’ ‘Inderdaad’, beaamt Krimpenfort, ‘Grotere aantallen muizen, en beter kijken.’ In binnen en buitenland werken labs steeds harder aan gedetailleerde fenotypering van veelgebruikte muizenlijnen (zie kader). Dat reikt tot in schijnbaar triviale details als aantallen bloedcellen, hormoonspiegels en hartfrequentie. Pas als die gegevens bekend zijn kan worden onderzocht of de knock-out wellicht subtiel verschilt van ongemodificeerde muizen.

Schellekens: ‘Wat ik binnen mijn instituut vooral zie is dat onderzoekers hun knock-outlijn gaan kruisen met andere muizenstammen. Een muis is veel meer dan het resultaat van een uitgeknockt gen. De genetische achtergrond is ook van invloed.’

Uit de literatuur zijn verschillende knock-outs bekend, die in het ene muizenras resulteerde in sterfte voor de geboorte, terwijl in de andere stam de dieren tot drie weken na de geboorte overleefden. Hetzelfde geldt voor de aantallen gezwellen die een dier ontwikkelt; in de ene stam nauwelijks, in de andere veel. Vaak komen onderzoekers zo interessante genen op het spoor die betrokken zijn bij het onderzochte ziekteproces.

Ondanks het feit dat knock-outs vaak geen dramatische effecten te zien geven, staat de rol van dit modeldier in genetisch onderzoek volgens Krimpenfort en Schellekens niet ter discussie. ‘Het heeft wel degelijk zin, het is hooguit complexer dan we dachten. Dat je in eerste instantie niets ziet, betekent niet dat verder onderzoek geen informatie oplevert’, zegt Krimpenfort. ‘Voor functional genomics blijft het de belangrijkste weg’, vindt Schellekens. ‘The proof of the pudding zit toch in de knock-out.’

Mouse phenome project

In een tijd waarin alle aandacht op DNA en de genotypering van organismen is gericht, komt een grootschalig fenotyperingsproject wat vreemd over. Toch is het internationale Mouse phenome project, geboren in 1999, wellicht harder nodig dan weer een complete genoomkaart. Want hoewel de genenkaarten van verschillende muizenstammen inmiddels in detail bekend zijn, is er weinig systematische kennis over de anatomische, fysiologische en gedragsparameters. Per stam wordt de variatie en sekseverschillen vastgesteld in standaardkenmerken als gewicht en groeisnelheid, maar ook bloed pH, cholesterol, gehoor, galsteenontwikkeling, hartslagfrequentie, orgaangewicht, etc.

Dergelijke kennis is onontbeerlijk om een knock-out mee te vergelijken. Als een onderzoeker een afwijkend gewicht en gedrag vermoedt is zonder kennis van de normale variatie in gewicht en gedrag van de gebruikte laboratoriumstam – zeg maar de basislijn – niet mogelijk om te bepalen of de ‘afwijking’ significant verschilt van de normale variatie. Daarom zijn uitspraken over subtiele afwijkingen bij een knock-out de uitkomst van een statistische analyse.

Literatuur:

Pearson, H (2002). Surviving a knockout blow. Nature 415: 8-9.