Je leest:

Moleculair vouwwerk

Moleculair vouwwerk

Auteur: | 1 april 2005

Op het raakvlak tussen biologie, natuurkunde en scheikunde bevindt zich het vakgebied van de biomoleculaire chemie. Een van de doelstellingen van deze tak van wetenschap is het ontrafelen van de driedimensionale structuur van de betrokken moleculen.

Op het raakvlak tussen biologie, natuurkunde en scheikunde bevindt zich het vakgebied van de biomoleculaire chemie. Deze tak van wetenschap, die zich bezighoudt met vraagstukken over de interacties tussen moleculen die noodzakelijk zijn voor levende organismen, stelt zich ten doel biologisch macroscopische processen te vertalen naar intermoleculaire processen. Een van de doelstellingen is het ontrafelen van de driedimensionale structuur van de betrokken moleculen. Infraroodspectroscopie van biomoleculen in de gasfase kan een belangrijke bijdrage leveren aan een beter begrip van de intramoleculaire krachten die deze structuren bepalen.

In het algemeen zijn moleculen met een biologische functie (kortweg biomoleculen) tamelijk groot. Een typisch eiwit bijvoorbeeld, bevat honderden individuele atomen, gerangschikt in een lang, ketenvormig molecuul. Een dergelijk lang molecuul bezit een enorme flexibiliteit die het in staat stelt zich als het ware op te rollen tot een compacte kluwen. Een goed voorbeeld hiervan is te zien in figuur 1, waar de structuur van het tamelijk eenvoudige eiwit hemoglobine is afgebeeld.

Figuur 1. Eiwitstructuur van hemoglobine. Hemoglobine bestaat uit vier in elkaar gewikkelde eiwitten (de tagliatelle-achtige slierten) en vier heemgroepen (niet zichtbaar) om de zuurstof moleculen te binden. Dat de heemgroepen in staat zijn zuurstofmoleculen te binden wordt ondersteund door de specifieke driedimensionale structuur van de eiwitten. Klik op de afbeelding voor een grotere versie

Hemoglobine is verantwoordelijk voor het transport van zuurstofmoleculen in het lichaam. Veel eigenschappen van de intermoleculaire reacties die plaatsvinden zijn direct gerelateerd aan de precieze vorm van de moleculen in kwestie. Meestal vinden interacties tussen biologische moleculen plaats op basis van een donor-receptor-proces waarbij de partners elkaar door middel van moleculaire patroonherkenning vinden. Bekende voorbeelden hiervan zijn desoxyribonucleïnezuur (DNA) en ribonucleïnezuur (RNA). Deze moleculen blijken maar op één unieke wijze met elkaar te wisselwerken, en zijn daardoor geschikt om de genetische code van levende organismen te bevatten. Ook de functionele werking van eiwitten, suikers en lipiden is vaak uitsluitend bepaald door de driedimensionale structuur van het biomolecuul. De unieke eigenschap van lange ketenmoleculen in het algemeen en biomoleculen in het bijzonder is dat ze, ondanks het enorme aantal vrijheidsgraden die ze bezitten, gemiddeld over de tijd eigenlijk altijd in één zelfde opgerolde toestand ofwel conformatie worden aangetroffen. Dit bepaalt voor een belangrijk deel de functionele werking van de moleculen. Voor een goed begrip van de werking van biomoleculen is het dus van belang dat de interacties die de conformatie bepalen in detail worden bestudeerd.

In oplossing of geïsoleerd?

De inter- en intramoleculaire interacties worden in biologische systemen sterk beïnvloed door de aanwezigheid van watermoleculen in de natuurlijke, waterige omgeving. Deze zogenaamde oplossingseffecten versluieren de fundamentele eigenschappen van de biomoleculen, wat het onderscheiden van de bijdragen van het molecuul zelf en van hun omgeving bemoeilijkt. Om dit onderscheid wel te kunnen maken, worden de hier beschreven experimenten gedaan aan moleculen die in de gasfase geïsoleerd zijn van hun omgeving. Op deze wijze zijn de fundamentele eigenschappen van de moleculen niet meer versluierd door oplossingseffecten. In vervolgstudies kunnen dan clusters van biomoleculen en watermoleculen worden bestudeerd waarbij door achtereenvolgende toevoeging van watermoleculen de oplossingseffecten als het ware worden opgebouwd.

De bindingssterkte tussen de individuele atomen binnen de moleculen is zodanig dat de moleculaire vibraties zich in het infrarode spectrale gebied bevinden. Voor de karakterisatie van de structuren van biomoleculen in de gasfase wordt daarom gebruik gemaakt van absorptiespectra in het infrarood, die gemeten kunnen worden met behulp van ion-dip-spectroscopie (zie het kader).

Meerdere onderzoeksgroepen maken ondertussen gebruik van infraroodspectroscopie om biomoleculen te kunnen karakteriseren. Meestal blijft het spectrale gebied dat bestudeerd wordt echter beperkt tot golflengtes korter dan circa 5 µm. De enige vibraties die in dit bereik gedetecteerd kunnen worden zijn de sterk gelokaliseerde strekvibraties van bijvoorbeeld enkele N-H-bindingen. De overgrote meerderheid van de moleculaire vibraties bevindt zich daarentegen bij langere golflengtes, en voor dit gebied bestaat nauwelijks data voor moleculen in goed gedefinieerde conformaties.

De experimenten die hier beschreven zijn maken gebruik van infrarood licht in het golflengtegebied tussen 5 en 100 µm. De infraroodstraling wordt geproduceerd door de vrije-elektronenlaser FELIX 1. Naast het grote golflengtebereik maken de continue afstembaarheid van de golflengte, de grote beschikbare pulsenergie (typisch 100 mJ in 5 µs) en de zeer acceptabele bandbreedte (~1% van de frequentie) dit instrument tot een ideaal hulpmiddel voor infraroodspectroscopie aan biomoleculen in de gasfase.

De experimenten worden gedaan in de gasfase, in een moleculaire bundel. Helaas is het geen triviale zaak om alle typen moleculen intact in de gasfase te brengen. Biomoleculen zijn in het algemeen slecht bestand tegen verhitting, omdat er fragmentatie plaatsvindt vóórdat sublimatie vanuit de vaste stof kan optreden. Voor de verdamping van deze moleculen is daarom een techniek ontwikkeld waarbij de moleculen op een goed gedefinieerd tijdstip vanuit een grafietmatrix met een gepulste desorptielaser in de gasfase worden gebracht. Deze desorptiebron wordt gecombineerd met een gepulste moleculaire bundel. Als nu de desorptielaser wordt gevuurd precies op het moment dat de moleculaire gaspuls zich boven de matrix bevindt, dan worden de biomoleculen onmiddellijk meegevoerd met die gaspuls. Door elastische botsingen met de edelgasatomen in de gaspuls worden de biomoleculen efficiënt gekoeld en raken ze vrijwel al hun interne energie kwijt. Er kunnen dan experimenten worden gedaan met een goed gedefinieerd sample van moleculen in hun vibrationele en elektronische grondtoestand.

Conformationele vingerafdruk

Voor een succesvol gebruik van infraroodspectroscopie ter karakterisatie van de verschillende conformaties van biomoleculen is het noodzakelijk dat de meetmethode voldoende toegerust is om überhaupt verschillende conformaties van moleculen te kunnen onderscheiden. Een belangrijke test voor dit experiment vormt het molecuul tryptophaan, de grootste van de aminozuurmoleculen, die op hun beurt weer de bouwstenen van eiwitten zijn. Van tryptophaan is bekend dat het in bundelexperimenten voorkomt in zes verschillende conformaties 2. Van drie van deze conformaties staan de infraroodspectra afgebeeld in figuur 2. Goed zichtbaar is dat de drie spectra duidelijk onderscheidbaar van elkaar zijn.

Figuur 2. Infraroodspectra (zwart) van drie conformaties van het aminozuur tryptophaan. Onder elk experimenteel spectrum staat het berekende spectrum (blauw) van de toegekende, ernaast afgebeelde structuur. De atoomtypen koolstof, zuurstof, stikstof en waterstof zijn respectievelijk oranje, rood, groen en wit gekleurd. Intramoleculaire waterstofbruggen zijn aangeduid met een lijntje. Klik op de afbeelding voor een grotere versie

Voor de interpretatie van de gemeten spectra worden quantumchemische berekeningen uitgevoerd met gebruik van de onder anderen door Nobelprijswinnaar Walter Kohn (Chemie 1998) ontwikkelde Density Functional Theory 3. Op een systematische wijze worden alle mogelijke configuraties geanalyseerd, waarna van de energetisch meest stabiele conformaties de infraroodspectra worden uitgerekend. Deze kunnen vervolgens worden vergeleken met de gemeten spectra, en op basis van deze vergelijking kunnen de spectra worden toegekend aan specifieke moleculaire structuren. Omgekeerd vormen de infraroodspectra natuurlijk een stringente test voor de huidige rekenmethodes. De meeste methodes maken gebruik van een harmonische benadering van de potentiële energie van het molecuul bij uitwijkingen van de atomen. Bij veel, hoofdzakelijk sterk gelokaliseerde vibraties is dit een volstrekt afdoende benadering. Bij meer gedelokaliseerde vibraties zou dit wel eens niet het geval kunnen zijn.

In dezelfde figuur 2 staan onder de gemeten spectra de berekende infraroodspectra van de toegekende structuren van tryptophaan. Van elke toegekende structuur (ernaast afgebeeld) is te zien welke intramoleculaire waterstofbrug voor extra stabiliteit van de configuratie zorgt. Op basis van de huidige spectra is het goed mogelijk specifieke structuren toe te kennen. Toch laat het voorbeeld van tryptophaan ook goed zien dat er beperkingen zijn aan de gebruikte theoretische methodes: een aantal vibratietypes blijken niet goed voorspeld te worden. Het bovenste experimentele spectrum in figuur 2 is een goed voorbeeld van sterk gelokaliseerde vibraties waar sterke overeenkomsten tussen alle gemeten en berekende resonanties bestaan, iets wat voor de andere twee aanzienlijk minder geldt.

Een tweede belangrijke conclusie uit het onderzoek aan dit molecuul is, naast de toekenning zelf, dat de toegekende structuren allen de energetisch meest stabiele conformaties zijn met deze specifieke intramoleculaire waterstofbrug.

DNA-patroonherkenning

Twee voorbeelden van experimenten laten duidelijk zien wat met deze methode mogelijk is, maar tonen anderzijds ook aan dat met het experimenteel vastleggen van de spectra de klus nog niet geklaard is. Het eerste voorbeeld behelst het complex van een purine- en een pyrimidinemolecuul in de gasfase, te weten guanine en cytosine. In DNA zijn dit twee van de vier moleculen die de twee ketens in het centrum bij elkaar houden. Het zijn ook deze zogenaamde nucleobasen die de genetische code bepalen: in ‘levend’ DNA bindt guanine zich alleen aan cytosine, en dan alleen op één specifiek wijze. In de gasfase is tot nog toe slechts één configuratie van het complex van deze (onafhankelijk van elkaar verdampte!) moleculen aangetroffen. Onder andere op basis van metingen bij felix, getoond in figuur 3, kan worden geconcludeerd dat dit complex niet dezelfde vorm heeft als in levend DNA. Alhoewel het sterk lijkt op de door Watson en Crick vijftig jaar geleden gevonden structuur 4, blijkt het om een chemisch licht verschillende vorm, een tautomeer, van cytosine te gaan.

Figuur 3. Infraroodspectrum van het in de gasfase gevormde complex van guanine en cytosine. De gevonden structuur is een andere dan degene die voorkomt in ‘levend’ DNA. Met rood is aangegeven dat cytosine in een ‘enol’-vorm (met een C-OH-groep) is gevonden, in plaats van in een ‘keto’-vorm (met een C=O-groep). Klik op de afbeelding voor een grotere versie

Zoals aangegeven in de figuur: cytosine is gevonden in een zogenaamde ‘enol’ vorm in plaats van de ‘keto’. Aan de ene kant geeft dit de kracht aan van de infraroodspectroscopie, die in staat blijkt dergelijke subtiele verschillen te kunnen ontsluieren. Anderzijds werpt het de vraag op: bestaat de Watson-Crick-configuratie dan wel in de gasfase, ook al is hiervoor een sterkere bindingsenergie voorspeld? Momenteel wordt druk gefilosofeerd over een mogelijk beschermingsmechanisme dat de in DNA aangetroffen configuratie tegen de schadelijke gevolgen van uv-absorptie beschermt, wat detectie in dit experiment onmogelijk maakt.

Tenslotte een voorbeeld waaruit blijkt dat de gebruikte theorie nog verbeterd zou kunnen worden maar het experiment wel goed werkt. In figuur 4 is het spectrum van een model disaccharide, lactose, afgebeeld. Het molecuul is synthetisch verrijkt met een benzeenring die de UV-absorptie-eigenschappen verbetert, maar weinig tot geen invloed op de conformatie van het molecuul uitoefent. De toekenning van het spectrum aan de afgebeelde structuur was niet mogelijk aan de hand van het afgebeelde theoretische spectrum. Gelukkig laat het infraroodspectrum in het nabije infrarood wél een ondubbelzinnige toekenning toe 5. Het is hier duidelijk dat de theoretische benaderingen vooral in het lage-frequentiebereik nogal te wensen over laten. De hier gepresenteerde gegevens kunnen dus als een stringente test voor geoptimaliseerde theorieën fungeren.

Figuur 4. Infraroodspectrum van gemodificeerd lactose. Hoewel onomstotelijk aangetoond is dat het spectrum van de juiste structuur afkomstig is, lijkt het berekende spectrum in het verre infrarood maar weinig op het waargenomen spectrum. Vooral het met de rode lijn aangeduide deel van het spectrum is hooguit kwalitatief lijkend. Klik op de afbeelding voor een grotere versie

Tot nut

Wat is nu het nut van studies aan gasfasemoleculen? Er is tenslotte geen enkel biologisch systeem dat zich niet in oplossing bevindt. Op deze vraag kan een aantal antwoorden worden gegeven. Ten eerste kunnen we door het toekennen van experimentele spectra aan berekende structuren uitvinden wat de belangrijkste redenen zijn waarom een molecuul zich juist zó opvouwt en niet anders. Welke krachten zijn belangrijk in dit proces? Zijn dat waterstofbruggen of spelen andere interacties nog een rol? Vooralsnog lijkt het er op dat het inderdaad voornamelijk waterstofbruggen zijn. Dat is bijvoorbeeld goed zichtbaar in de structuur van lactose (figuur 4) waarin een soort netwerk van interne waterstofbruggen bestaat die de conformatie stabiliseert.

Daarnaast vormen de infraroodspectra een uitstekende set van data waarmee modellen kunnen worden getest. Aangezien de vibrationele eigenschappen van een molecuul redelijk eenvoudig te berekenen zijn wanneer de bindingsenergie als functie van de moleculaire vrijheidsgraden bekend is, geldt elk extra molecuul waarvan het infraroodspectrum bekend is als een goede test van het ontwikkelde model. Zulke modellen zijn bijvoorbeeld van belang voor biochemici en de farmaceutische industrie: voor de typische grootte van de moleculen die daar onderwerp van onderzoek zijn, is het onmogelijk om qua rekenkracht state-of-the-art quantumchemische berekeningen uit te voeren. In plaats daarvan wordt gebruik gemaakt van zogenaamde krachtveldmodellen, waarin de interacties tussen verschillende atomen met een Newtoniaans krachtenveld geparametriseerd zijn.

Vooral voor deze krachtveldmodellen is het van groot belang dat thans metingen mogelijk zijn in het verre infrarood. Omdat nu de mogelijkheid bestaat het gebrek aan data over meer gedelokaliseerde vibraties op te vullen, kunnen de bestaande modellen op een meer universele wijze getest en verfijnd worden.

In de medische wereld zou dit onderzoek een bijdrage kunnen leveren aan bijvoorbeeld het begrip van prionziekten en de ziekte van Alzheimer. Bij deze ziekten leidt een kern van ‘verkeerd’ gevormde eiwitten tot een kettingreactie waarbij alle eiwitten van een bepaald type verkeerd vouwen, met verstrekkende gevolgen. Als we zouden begrijpen waarom deze eiwitten nu juist zo vouwen, zouden tegenmaatregelen effectiever kunnen worden genomen.

Ion-dip-spectroscopie. Bij ion-dip-spectroscopie worden de moleculen blootgesteld aan infrarood licht dat ze uit de grondtoestand naar een vibrationeel aangeslagen toestand kan pompen (zie figuur). De overgebleven bevolking van de grondtoestand wordt daarop bemonsterd door een zeer goed gedefinieerde elektronische overgang te induceren met een ultraviolet foton, waarna de moleculen geïoniseerd en gedetecteerd worden. Als het infrarood licht een overgang in de geselecteerde moleculen induceert, blijven er minder moleculen in de grondtoestand ter bemonstering over dan anders. Dit vertaalt zich in een vermindering van het aantal geproduceerde en gedetecteerde ionen, een ion-dip. Door nu het aantal geproduceerde ionen te meten als een functie van de infraroodgolflengte wordt het infrarood ion-dip-spectrum verkregen. Het ion-dip-spectrum kan vervolgens redelijk eenvoudig tot een infrarood absorptiespectrum worden geconverteerd. Aangezien de elektronische overgang die door de ultravioletlaser wordt ge-induceerd voor elke conformatie van een molecuul anders is, wordt voor een gekozen ultraviolette golflengte slechts van een moleculaire conformatie het infraroodspectrum gemeten.

Referenties

1: http://www.rijnh.nl/felix/. 2: L.C. Snoek et al., Phys. Chem. Chem. Phys. 3 (2001), 1819. 3: http://nobelprize.org/chemistry/laureates/1998/kohn-lecture.pdf. 4: J. Watson en F. Crick, Nature 171 (1953), 737 http://nobelprize.org/medicine/laureates/1962. 5: R.A. Jockush et al., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004), 5709.

Bezoek de website van het Nederlands Tijdschrift voor Natuurkunde

Dit artikel is een publicatie van Nederlands Tijdschrift voor Natuurkunde.
© Nederlands Tijdschrift voor Natuurkunde, alle rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 01 april 2005

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.