Een van de meest wonderlijke zoetstoffen komt voor in een plant die in Midden-Afrika groeit: de Katemfe. Al eeuwenlang gebruikt de plaatselijke bevolking de Katemfevruchten als zoetmiddel. Twintig jaar geleden kwam een Nederlandse onderzoeker bij Unilever erachter welke stof voor deze zoete smaak verantwoordelijk is. Het bleek een eiwit te zijn, een keten van ruim 28.200 aminozuren. Het eiwit kreeg de naam thaumatine, naar de Latijnse benaming voor de plant (Thaumatococcus daniellii).
De kleur van chemie
Dit artikel is afkomstig uit het hoofdstuk ‘Suiker’ uit de VU-uitgave ‘De kleur van chemie’, een bundeling van informatieve brochures voor havo/vwo scholieren.
Deze ontdekking was de doodsteek voor een theorie die zei dat zoete moleculen niet groot kunnen zijn – in ieder geval niet veel groter dan sucrose. Het thaumatinemolecuul was véél groter, met een molecuulmassa van ongeveer 22.000. Bovendien was het ’t zoetste molecuul dat ooit ontdekt was: vele duizenden malen zoeter dan gewone suiker (op molecuulbasis zelfs een factor honderdduizend). De stof heeft bovendien smaakveranderende eigenschappen. De smaak blijft minutenlang aan, en als je in die tijd een zure vloeistof drinkt, proeft die ook zoet.
Te groot om na te maken
Jammer genoeg is de Katemfe een moeilijk te kweken plant en groeit hij alleen in de tropen. Eén kilo natuurlijk thaumatine kost daarom ongeveer 15.000 euro.
Goedkoper thaumatine in handen krijgen is langs chemische weg nauwelijks uitvoerbaar. Het molecuul is simpelweg te groot om het in het lab zo maar even na te maken. Maar omdat thaumatine een eiwit is, zou het wél via een biotechnologische route gemaakt kunnen worden.
Het idee daarbij is om andere organismen (bacteriën bijvoorbeeld, of gistcellen) te verleiden om heel efficiënt thaumatine te gaan aanmaken. Met zulke industriële biotechnologische productie is al de nodige ervaring. Bijvoorbeeld bij de vervaardiging van het antibioticum penicilline, of van stremsel voor de kaasbereiding. Het is dus best een goed idee om te proberen zo ook goedkoper thaumatine te gaan maken. De uitvoering van dat idee blijkt echter verre van eenvoudig.
Op zoek naar het gen
Boodschappermoleculen
De recepten op het chromosoom worden altijd eerst overgeschreven op een soort boodschappenbriefjes. Dit zijn de boodschapperRNA-moleculen, in het Engels messenger-RNA (kortweg mRNA). Deze boodschappenbriefjes gaan van de celkern (de bibliotheek) naar de plaats in de cel waar de eiwitten gemaakt worden (de keuken). Volgens de genetische code, de DNA-taal waarin deze boodschappen geschreven zijn, duidt elk drie-letter-woord een aminozuur aan. De ribosomen, speciale celstructuren die de eiwitten produceren (de koks), lezen deze boodschappenbriefjes en zoeken bij elk woord van het recept het bijbehorende aminozuur. Al deze aminozuren worden dan netjes aan elkaar geregen tot een eiwit.
Om te beginnen is het zaak het ‘thaumatine-recept’ te vinden dat opgeslagen ligt in de chromosomen (het DNA) van de katemfeplant. De chromosomen zijn te vergelijken met een serie kookboeken met daarin álle recepten die voor de levende cel van belang zijn. Ergens in één van deze ‘cellulaire kookboeken’ van de Katemfe-plant moet het recept van thaumatine staan: het thaumatine-gen.
Een aantal bedrijven, waaronder Unilever, is er in geslaagd het thaumatine-gen op te sporen en vervolgens aan het werk te zetten. Een deel van dat onderzoek werd – samen met Unilever – uitgevoerd bij de afdeling Biochemie en Moleculaire Biologie van de Vrije Universiteit in Amsterdam. Ronald Bergkamp en Michiel Harmsen werkten er aan mee. Ze leggen uit hoe het thaumatine-gen gevonden is door goed te kijken naar het cellulaire proces van eiwitproductie.
Om het thaumatine-gen op te sporen hebben de onderzoekers eerst alle boodschapperRNA moleculen verzameld in cellen die erg veel thaumatine maken. Vervolgens zochten ze uit welke boodschapper-RNA moleculen precies verantwoordelijk waren voor de aanmaak van het thaumatine. Daarna gebruikten ze een speciaal enzym om de informatie van het boodschapper-RNA ‘terug te vertalen’ naar het oorspronkelijke recept: het stukje DNA van het thaumatine-gen.
DNA vermeerderen
De beschreven procedure levert maar heel weinig DNA op. Gelukkig is via kloneren snel veel van hetzelfde DNA te verkrijgen. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een zogenaamde bacteriofaag (een bacterievirus). Het te vermeerderen DNA wordt met behulp van enzymen ingebouwd in het DNA van zo’n faag. Als daarna een bacterie aan de behandelde faag wordt blootgesteld, vindt vanzelf de vermenigvuldiging plaats. Net als andere virussen gebruikt de faag namelijk zijn gastheer, de bacterie, om zichzelf sterk te vermenigvuldigen. Daarbij vermenigvuldigt hij dus het stukje DNA direct mee. Het faag-DNA is vervolgens uit de bacteriecellen te oogsten, waarna de thaumatine-genen er weer uit worden geknipt..
Gist als thaumatinefabriek
De volgende stap was het inbouwen van het thaumatine-gen in een cel die aan de hand van het recept thaumatine gaat maken. En dan liefst op veel grotere schaal dan de katemfe-vrucht het zelf doet. Voor dit werk gebruikt een biochemicus meestal bacteriën of gistcellen. De VU-onderzoekers kozen voor gist.
Waarom gist?
Allereerst is gist een veilig organisme. Het heeft de zogenaamde GRAS-status – de afkorting staat voor Generally Recognized As Safe. Bakkersgist is al eeuwen in gebruik in voedsel en bij jarenlang gebruik in de voedselindustrie heeft men nooit iets van giftigheid gemerkt. Van bacteriën daarentegen is bekend dat ze ook giftige delen bevatten, met name bepaalde eiwitten uit de celwand. Gist is ook een wat hoger ontwikkeld organisme dan een bacterie. Daardoor komt het gist-DNA meer overeen met het in te bouwen planten-DNA, en dat vergemakkelijkt de eiwitproductie. Tenslotte lijkt het uitscheidingssysteem van gist meer op dat van hogere organismen, zodat de isolatie van het eiwit (in dit geval het thaumatine) eenvoudiger wordt.
Met behulp van zogenaamde plasmiden smokkelden de onderzoekers het thaumatine-gen bij het gist naar binnen. Plasmiden zijn cirkelvormige stukjes DNA die, los van de chromosomen, in de kern aanwezig zijn. Ze kunnen zichzelf vermenigvuldigen en zorgen ervoor dat genetische informatie tussen bacteriën onderling en zelfs tussen verschillende soorten wordt uitgewisseld. Met behulp van knip-en-plak-enzymen bleek het relatief kleine thaumatine-gen vrij gemakkelijk in het DNA van een plasmide in te bouwen. Door het plasmide in contact te brengen met de gistcellen werd het gen vervolgens vanzelf opgenomen in het DNA van de gistcel.
Recept gemist
Werkte het nu? Niet helemaal. De aangepaste gistcel bleek maar mondjesmaat thaumatine te produceren. Vaak werd het gen door de cel niet goed ‘gezien’ en dus niet afgelezen. Dat had te maken met de ‘promotor’ van het gen, die niet actief genoeg bleek. Zo’n promotor is een soort herkenningssignaal, vastgelegd in een stukje DNA aan het begin van het gen. Je zou het kunnen vergelijken met een vetgedrukte kop boven een recept, om aan te geven dat daar een nieuw recept begint. De oorspronkelijke promotor van het thaumatine-gen uit de katemfeplant bleek in gist niet zo goed op te vallen. Er moest dus een gistpromotor bijgezet worden. Dat hielp: het plaatsen van deze gistpromotor vóór het thaumatine-gen leverde tienmaal meer boodschapper-RNA op.
Met al die boodschappenlijstjes zou je verwachten dat er meer dan genoeg van het thaumatine-eiwit werd gemaakt. Maar nog was het project geen succes. De gistcel bleek niet zo geweldig met de lijstjes uit de voeten te kunnen. Hier dook het probleem op dat er van de zogenaamde ‘universele’ DNA-code toch een paar ‘dialecten’ in omloop zijn. Van de drie DNA-‘letters’ die coderen voor een aminozuur, zijn de eerste twee vrijwel altijd hetzelfde. Maar de derde letter kan variëren. Hogere planten hebben voor die derde letter een andere voorkeur dan gist. Daardoor hebben de gistribosomen wat moeite met het lezen van de boodschap van het oorspronkelijke boodschapper-RNA voor thaumatine. Dit probleem is opgelost door het thaumatinegen ‘na te bouwen’ volgens de code die bij gist de voorkeur heeft: elke derde letter werd ‘aangepast’. Door dit ‘verbeterde’ thaumatine-gen te gebruiken lukte het de onderzoekers om tien maal zo veel thaumatine uit de gistcellen te krijgen als met het oorspronkelijke gen. Eindelijk was de microbiologische thaumatine-fabriek gereed!
Niet altijd zoet
Na al deze moeite kwam de volgende verrassing: het door de gistcel precies nagemaakte thaumatine bleek helemaal niet zoet! Alleen wanneer de thaumatine-eiwitketen op één bepaalde manier gevouwen was, ontstond de gewenste zoete smaak. Deze ‘zoete structuur’ is het gevolg van maar liefst 8 zwavelbruggen (-S-S-) tussen 16 aanwezige S-H groepen in het eiwit.
Het onderzoek aan thaumatine is nu in dit stadium. Buiten de gistcel blijkt dat vouwen wél op de goede manier te lukken. Michiel Harmsen probeert het probleem op te lossen door vóór het thaumatine-gen een eiwit-uitscheidingssignaal van gist in te bouwen: “Daardoor wordt het gevormde thaumatine meteen de cel uitgespuugd, net zo als andere door gist uitgescheiden eiwitten. Het is dan de bedoeling dat het nog ongevouwen thaumatine direct in de kweekvloeistof terecht komt, waar het zich vanzelf goed opvouwt en zwavelbruggen vormt.”
Ronald Bergkamp vult nog aan dat thaumatine dan op grote schaal gemaakt zou kunnen worden via een batch-proces: “Je laat de gist met de thaumatine-genen eerst een tijdje groeien en voegt dan druppelsgewijs verse kweekvloeistof toe. Daardoor beginnen de cellen als een gek te delen en thaumatine uit te scheiden. Als je daarna de gist afcentrifugeert, kun je de zoetstof uit de bovenstaande vloeistof gemakkelijk isoleren.
Deze voorgestelde bereiding van thaumatine is in principe niet duur, maar het is nog niet zeker of de productie commercieel lonend is. Er zijn immers al heel veel andere – goedkope – zoetmiddelen op de markt. Maar de onderzoekers hebben nu wel geleerd hoe ze op deze manier ook allerlei andere eiwitten kunnen maken, die wellicht commercieel beter lonend zijn.
Ondanks het lange ontwikkelingstraject heeft Unilever afgezien van de biotechnologische productie van thaumatine met genetisch gemodificeerde gistcellen. De negatieve publieke perceptie van genetische modificatie was daar waarschijnlijk voor een belangrijk deel debet aan. Zoetjesproducent Natrena (onderdeel van Sara Lee) heeft wel enige tijd natuurlijk thaumatine verwerkt in Natrena Gourmet. Dit product is in Nederland inmiddels niet meer te koop. In Duitsland wordt thaumatine nog wel gebruikt door de zoetstofproducent, daar onder de naam Natreen. De Franse firma Naturex brengt natuurlijk thaumatine op de markt onder de naam Talin. In de ingrediëntenlijst op de etiketten van voedingsmiddelen is thaumatine te herkennen als E-957.
Lees ook:
- Zoeter dan zoet (Kennislinkartikel uit Chemie achter de Dijken)
Vrije Universiteit Amsterdam
Het boek ‘De kleur van chemie’ werd in 2007 uitgegeven door de Faculteit der Exacte Wetenschappen van de Vrije Universiteit Amsterdam (Afdeling Scheikunde en Farmaceutische Wetenschappen). Het is een geactualiseerde bundeling van informatieve brochures voor havo/vwo scholieren. Ze belichten de rol van de scheikunde op tal van gebieden.