Je leest:

Kleurige beelden van levende cellen

Kleurige beelden van levende cellen

Auteur: | 1 maart 2008

Eiwitten in levende cellen zien bewegen. Dat en nog veel meer is nu mogelijk met confocale lasermicroscopie waarbij een palet aan ‘gekleurde’, fluorescente eiwitten wordt gebruikt. ‘Het leven is de interactie tussen eiwitten.’

Samen zitten we achter vier grote beeldschermen naast een digitale confocale microscoop met lasers en dikke kabels. Met al die ICT lijkt de werkplek wel op die van een beurshandelaar of een IT-specialist. Maar dat is schijn. NKI-AVL onderzoeker Kees Jalink: ‘Sommige onderzoeksgroepen verliezen langzamerhand het zicht op de werkelijkheid. De beeldvormende techniek wordt dan doel op zich. Maar het draait om de biologie: we moeten een bijdrage leveren aan het biologisch onderzoek door iets te laten zien wat mensen op een andere manier niet te weten kunnen komen. Zeventig procent van wat wij publiceren gaat ook over biologie.’

Als je cellen echt wilt doorgronden, kun je ze maar beter in levende toestand bestuderen. Zo zou je het adagium van Jalink kunnen omschrijven. Dat klinkt misschien triviaal, maar veel biologen beginnen nu juist met het grondig doodmaken. Weefsels en cellen worden naar hartelust gelyseerd, gehomogeniseerd, gefixeerd en in plakjes gesneden. Levende cellen zijn zo veranderlijk en beweeglijk dat de onderzoekers ze het liefst in een bepaald stadium ‘bevriezen’.

Het resultaat is inzicht in een statische momentopname van een incomplete situatie. En die kan weinig vertellen over dynamische processen. Hoe snel een cel reageert op bepaalde prikkels is zo lastig te achterhalen. En ook van de levensnoodzakelijke beweging is niets te zien: membranen en cytoplasma stromen, het celskelet verandert voortdurend van vorm, en daar tussendoor diffunderen eiwitten en signaalstoffen. Al die interacties kunnen niet op een eiwit-gel of onder een elektronenmicroscoop worden gevangen.

Trucs

Met een paar muisklikken tovert Jalink levende cellen op de schermen. Kleurige beelden van kankercellen die langzaam uit beeld wegwandelen terwijl ze een soort van celpootjes uitstrekken. En niercellen die reageren op prikkels met veranderingen in de intracellulaire calciumconcentraties – veranderingen die als regenboogkleurige pulsen door de cel golven.

‘Het leven is de interactie tussen eiwitten’, aldus Jalink. Dat uitgangspunt is de basis voor een hele reeks meettechnieken (zie kader). De onderzoeker gebruikt een alsmaar uitbreidend arsenaal aan fluorescerende eiwitten, voornamelijk groene fluorescerende eiwitten (GFP’s) uit de kwal Aequorea victoria veranderd tot een palet met tientallen kleuren.

Golflengtes

De DNA constructen die coderen voor deze kleureiwitten kunnen in het lab gekoppeld worden aan menselijke genen. De zo ontstane fusie-eiwitten worden vervolgens in een cellijn tot expressie gebracht, waarna het onderzoek onder de microscoop kan beginnen. Als het fusie-eiwit interacties aangaat met andere eiwitten, of zich verplaatst naar de kern of het celmembraan, is dat met de confocale microscoop op het computerscherm te volgen en zeer nauwkeurig te meten.

Met een lichtmicroscoop kan dat niet. De resolutielimiet voor de lichtmicroscopie ligt namelijk op 250 nanometer. Kleinere structuren kunnen met een lichtmicroscoop niet in beeld worden gebracht. Maar eiwitten zijn nog vijftig maal kleiner, en hun interacties spelen zich binnen de tien nanometer af. Daarom zijn die nieuwe technieken nodig. Jalink: ‘Het is niet zo dat we nu optisch steeds verder kunnen inzoomen, maar we kunnen wel steeds nauwkeuriger interacties meten.’

Sinds kort beschikt Jalink over een zogenaamde witlaser van Leica. Daarmee kan met een paar muisklikken elke gewenste golflengte laserlicht worden geproduceerd. ‘Tot voor kort beschikten we over hooguit acht golflengten. Dat beperkte je in je keuze van fluorescerende eiwitten, omdat de golflengtes waarmee je ze aanstraalt soms gedeeltelijk overlapt. Nu kun je precies de optimale golflengte selecteren.’ Jalink verwacht met de nieuwe laser nog meer informatie over cellulaire processen aan het licht te brengen.

Confocale technieken:

Er zijn inmiddels diverse technieken ontwikkeld waarmee met de confocale lasermicroscoop het gedrag van individuele eiwitten kan worden bestudeerd.

FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer)

Interacties tussen eiwitten zijn bepalend voor veel cellulaire processen, zoals het doorgeven van signalen naar de kern door receptoren in het celmembraan. FRET kan die interacties meten met twee verschillende fluorescente eiwitten, bijvoorbeeld een groene en een rode, gekoppeld aan twee cellulaire eiwitten. Als beide eiwitten een nauwe interactie aangaan vindt er energietransfer plaats van het ene naar het andere fluorescente eiwit. Die verschuiving in fluorescentiekleur is een maat voor de interactie tussen eiwitten.

FLIM (Fluorescent Lifetime Imaging)

Deze FLIM techniek kijkt naar het ‘verval’ van aangeslagen fluorescente eiwitten. Als fluorescente eiwitten met laserlicht worden aangestraald, zullen ze dat licht absorberen en vervolgens licht van een langere golflengte uitstralen. Dat doen de eiwitten niet allemaal precies tegelijk, maar volgens een exponentiele curve. In dat opzicht is dit ‘lichtverval’ vergelijkbaar met het vervallen van een radioactieve isotopen. Bij fluorescente eiwitten blijkt de vervalsnelheid sterk afhankelijk van de omgeving. Zo is bijvoorbeeld het verval van een geel fluorescent eiwit afhankelijk van de cellulaire pH. Daarmee kan met FLIM de pH worden gemeten en in beeld worden gebracht.

FRAP (Fluorescent Recovery After Photobleaching)

Deze techniek draait om het met laserlicht vernietigen (bleken) van fluorescente eiwitten in een klein volume in de cel. Daarna wordt gekeken hoe lang het duurt voordat de gebleekte plek door diffusie weer is verdwenen. De snelheid waarmee die diffusie plaatsvindt is afhankelijk van de massa van het fluorescente eiwit. Als er bijvoorbeeld andere eiwitten binden aan een fluorescent eiwit wordt de diffusiesnelheid lager. De hersteltijd na bleken is dan langer.

FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy)

Deze techniek gebruik zeer kleine hoeveelheden fluorescerend eiwit, zo’n honderd tot duizend moleculen per cel. Gemiddeld is er dan maar één fluorescerend molecuul per beeldblokje (voxel) aanwezig. Het fluorescente eiwit diffundeert in milliseconden door het beeldhokje. Door het beeld van een cel op te delen in duizenden voxels, kunnen zeer veel, zeer nauwkeurige metingen worden verricht. Uit de precieze timing daarvan kan informatie over eiwitcomplexen worden gehaald. "

Oeps: Onbekende tag `feed’ met attributen {"url"=>"https://www.nemokennislink.nl/kernwoorden/cel/index.atom?m=of", “max”=>"5", “detail”=>"minder"}

Dit artikel is een publicatie van Bionieuws.
© Bionieuws, alle rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 01 maart 2008

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.