Het is een beetje een rare naam voor een nieuwe techniek: next generation sequencing, kortweg NGS. Alsof er nooit weer een volgende generatie technieken zal komen om de bouwsteentjes van een DNA-streng af te lezen (het sequencen). Maar de naam geeft wel aan dat, toen deze techniek aan het begin van deze eeuw haar intrede deed in het genetische onderzoek, dit een ongelooflijk grote stap voorwaarts was ten opzichte van de oude techniek (de Sanger-methode), die al zo’n 25 jaar trouwe dienst deed. Nog steeds vinden er verbeteringen in snelheid en nauwkeurigheid plaats aan deze next generation sequencing, die in feite bestaat uit diverse technieken. Vandaag de dag lezen we DNA-codes af met een ongekende snelheid van wel 6 miljard letters in 24 uur. Dat is 10.000 keer sneller dan de oude Sanger-methode die ongeveer 100.000 letters per 24 uur af kon lezen. En NGS is niet alleen veel sneller, het is ook 10.000 keer goedkoper.
In stukken knippen
Het aflezen van een DNA-code met next generation sequencing vereist vier stappen. Allereerst moet het DNA uit de celkernen worden geïsoleerd. Dat zit bij mensen als een dubbele draad van vele honderden miljoenen bouwsteentjes lang opgevouwen en opgerold in 23 paar chromosomen. De draden zitten goed verpakt in combinatie met allerlei eiwitten en andere moleculen die zowel het DNA beschermen als de beschikbaarheid ervan in de kern regelen. Al die stoffen moeten worden verwijderd om ‘schone’ DNA-strengen over te houden om de lettervolgorde af te kunnen lezen. Strengen van gezuiverd DNA zijn niet stevig en breken gemakkelijk als je er mee werkt. Om DNA goed af te kunnen lezen wordt het in stukken gebroken van elk 300 tot 400 bouwsteentjes lang. DNA bevat vier verschillende bouwsteentjes die worden aangeduid met de letters A, T, C en G. Aan beide uiteinden van elk stuk DNA plakken de onderzoekers zelfgemaakte stukjes DNA die dienen als zowel het start- als eindpunt voor het aflezen – DNA bestaat uit een dubbele streng van twee omgekeerd liggende identieke ketens. Die startpunten zijn 40 letters lang en de onderzoekers kennen de volgorde van de letters. Nu is het DNA klaar voor stap twee.
Kleine bolletjes
Het aflezen van de lettervolgorde van het DNA geschiedt met licht of via een elektrisch signaal. Het signaal dat van één DNA-streng komt, is zo zwak dat het niet te meten valt. Om toch een zichtbaar lichtstipje op een foto te krijgen, moet een enkele DNA-streng tienduizenden keren worden vermenigvuldigd tot een kluitje strengen dat groot genoeg is om een meetbaar signaal te geven. Daartoe dient stap twee. Daarin worden de DNA-strengen met een lengte van 300 tot 400 bouwstenen gemengd met hele kleine bolletjes van enkele honderdsten millimeters groot waaraan het DNA blijft plakken. De bedoeling is dat aan elk bolletje één stukje DNA plakt. Dat is eenvoudiger dan het lijkt: neem tien keer zoveel bolletjes als DNA-strengen, meng goed en klaar is Kees. Door een mengsel van olie en een waterige oplossing toe te voegen, wordt elk bolletje afzonderlijk omsloten door een vettig omhulsel, waarbij de vetmoleculen aan de buitenkant zitten en de waterige oplossing aan de binnenkant. In de oplossing zitten alle benodigde stoffen, zoals de verschillende DNA-bouwsteentjes, en specifieke eiwitten voor het kopiëren van het DNA dat aan het bolletje is geplakt. Het afwisselend verhogen en verlagen van de temperatuur zet de vermenigvuldiging van het DNA in gang en zo ontstaan vele kopieën van elk stukje DNA. De eerder aangebrachte startpunten zorgen dat het vermenigvuldigingseiwit (het DNA-polymerase) bindt aan de uiteinden van elk stukje DNA. Behalve door het toepassen van de bolletjes kunnen wetenschappers ook met tal van andere vernuftige methodes kleine en grotere stukjes vermeerderen; bijvoorbeeld op een glasplaatje of loszwevend in een oplossing.
Een moderne DNAsequencer (de Illumina HiSeq 2500) die ongeveer 1 miljard bouwsteentjes per dag leest.
Stichting Biowetenschappen en Maatschappij
Drie miljard letters en lege handen
Het duizend-dollar genoom is bijna werkelijkheid: voor zo’n duizend dollar krijgen we nu de totale lijst met drie miljard letters (basenparen) van iemands DNA in handen. In één dag. Maar die enorme hoeveel informatie, is niet hetzelfde als kennis en zeker niet als wijsheid. Het interpreteren van die ruwe data kost nog veel inspanning, tijd en geld en levert soms weinig op. Een voorbeeld: een test wijst uit dat ie-mand een kleine en bekende variatie heeft in een gen dat is betrokken bij diabetes. De meting is 99 procent betrouwbaar en de variatie vermindert het risico op suikerziekte met 10 procent: daardoor verlaagt de kans om diabetes gedurende het leven te krijgen van 20 procent naar 18 procent. Daarvan zal niemand wakker liggen. Deze cijfers zijn typisch voor veelvoorkomende, complexe aandoeningen (die door zowel genetische als niet-genetische factoren worden bepaald) zoals diabetes type 2. Veelvoorkomende aandoeningen kunnen (nog) zelden goed worden voorspeld met DNA-tests. We weten nog onvoldoende van de manier waarop genen verantwoordelijk zijn voor ziekte en gezondheid. Het zal nog wel een paar decennia duren voordat we die kennis in handen hebben. En het is zeer de vraag of mensen die kennis dan (wijs) gaan gebruiken om zo nodig hun leefstijl aan te passen. Eline Bunnik
99,99 procent nauwkeurig
De derde stap is het daadwerkelijk aflezen van de lettervolgorde in het DNA. Apparaten van verschillende fabrikanten doen dat vaak op een net iets andere manier. Een van de technieken is om in verschillende opeenvolgende rondes steeds één letter (A, T, C of G) in het DNA te laten inbouwen. De DNA-bouwstenen zijn daarvoor zo aangepast dat ze onder laserlicht elk een andere kleur geven. Zo kan worden bepaald in welke volgorde de A’s, T’s, C’s en G’s worden ingebouwd. In plaats van met licht lezen sommige apparaten de volgorde af doordat het inbouwen van een letter een signaal geeft dat elektrisch wordt gemeten. In de figuur hieronder is het afleesproces met laserlicht van de Illumina HighSeq in beeld gebracht.
Aan het begin van het DNA-afleesproces waren de lange DNA-strengen in vele miljoenen stukjes gebroken. De laatste stap voegt die losse stukjes weer samen tot de complete lettervolgorde van de oorspronkelijke DNA-streng. Rond de eeuwwisseling werd voor het eerst de DNA volgorde van de mens afgelezen. Deze volgorde is via het internet beschikbaar als referentie-DNA. Aan de hand van de referentie zoeken slimme en supersnelle computers uit waar elk stukje in de puzzel hoort (zie de figuur op pagina 18). Het proces van aflezen is behoorlijk nauwkeurig, maar om fouten in de uiteindelijke volgorde te voorkomen, wordt iedere letter 20 tot 40 keer afgelezen. Daardoor wordt de nauwkeurigheid van het aflezen wel 99,99 procent.
Polymerase at work
De firma 454 Life Sciences (inmiddels overgenomen door farmabedrijf Roche) was in 2005 de eerste die een NGS-apparaat verkocht. De ontwikkelingen staan echter niet stil. De allernieuwste apparaten slaan de vermenigvuldigingsstap (stap 2) over en gebruiken direct de enkelvoudige DNA-strengen om het signaal uit te lezen (dat heet single molecule sequencing). Dat kan doordat de apparatuur – vooral de camera’s – zo gevoelig zijn geworden dat één streng genoeg signaal geeft voor een foto. Het systeem van de firma Helicos werkt daarbij met alle letters in dezelfde kleur die één voor één worden toegevoegd. Inbouw van een letter geeft een stipje op de foto (inbouw van twee letters tegelijk is onmogelijk gemaakt). Het apparaat van Pacific Biosciences gaat nog een stapje verder: elke letter heeft een eigen kleur en het gebruikt een filmcamera. Dit apparaat maakt feitelijk een filmpje van een polymerase-eiwit dat een DNA-streng kopieert en de letters één voor één inbouwt. De gebruikte bouwstenen geven licht en als een letter wordt ingebouwd zie je een lichtsignaal, waarbij de kleur aangeeft om welke letter het gaat. Het eindresultaat is een film van flikkerende stipjes.
De prestaties van de diverse apparaten verschillen sterk. Het ene apparaat kan bijvoorbeeld snel korte stukjes DNA aflezen, terwijl het andere apparaat weer heel nauwkeurig is. Daarnaast zijn de bedrijven in een heftige concurrentiestrijd verwikkeld om de technologie nog verder te verbeteren. Dit leidt ertoe dat ieder jaar meer letters gelezen kunnen worden voor hetzelfde geld. Vooralsnog is het doel dat het gehele DNA van één persoon voor duizend dollar kan worden afgelezen. Zover is het nog niet, maar dat duurt niet lang meer.
Meer dan alleen letters
Met een beeldscherm vol reeksen met letters alleen, ben je er nog niet. De kennis achter die letterreeksen is nog veel belangrijker. Wetenschappers hebben met behulp van krachtige computers in het DNA van de mens, dat 3,2 miljard letters telt, inmiddels zo’n 22.500 genen gevonden. Daarnaast zijn vele andere gebieden gevonden die belangrijk zijn om de activiteit van al die genen goed te regelen – hoeveel activiteit van welke genen is er wanneer en waar in het lichaam nodig? Van een groot deel van het DNA is de precieze functie nog onbekend. Dat deel wordt door de voortgaande inspanningen van talloze onderzoekers iedere dag kleiner.
Van sommige genen of gebieden van het DNA weten we dat ze direct zijn betrokken bij een bepaalde eigenschap of een bepaald proces in het lichaam. Een variatie in de volgorde op die plek leidt dan tot een andere eigenschap – bijvoorbeeld of je wel of geen bittere smaak kunt proeven en welke bloedgroep je hebt – of tot een verandering in een lichaamsproces – bijvoorbeeld dat rode bloedcellen minder gemakkelijk zuurstof opnemen of spieren verzwakt zijn. Op dit moment zijn verreweg de meeste eigenschappen en processen (nog) niet een-op-een te koppelen aan bijbehorende variaties in de DNA-volgorde. Vaak komt dit doordat zo’n eigenschap wordt bepaald door het samenspel van diverse genen. Daarnaast zijn invloeden van buitenaf zeer belangrijk, zoals de levensstijl van de eigenaar van het DNA (eten, drinken, bewegen, huisvesting, klimaat). Hoewel nog lang niet alles bekend is van ons DNA, kunnen we er toch al veel mee. Kon bijvoorbeeld tien jaar geleden de oorzaak van een erfelijke ziekte alleen worden opgehelderd door jarenlang gedegen onderzoek, tegenwoordig kan dat vaak binnen een maand. Lees dus gewoon al het DNA af en kijk of ergens een foutje in een gen zit. Klaar!