De gouden teller staat op 1000. Volgens de Genomes OnLine Databank, kortweg GOLD, is op 19 mei 2009 het duizendste complete genoom publiek gemaakt. Het jubileumorganisme is Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385, een bacterie geïsoleerd uit mensenspuug. Biotechnologen van de universiteit Bielefelt brachten het genoom van 2446 kilobasen van deze bacterie in kaart door via ultrafast pyrosequencing. De belangrijkste verdienste van de bacterie is dat hij géén mycolinezuur in de celwand aanmaakt, terwijl dit het belangrijkste bestanddeel is van een grote groep ziekteverwekkende bacteriën, waaronder de beruchte tuberculosebacterie.
De mijlpaal is waarschijnlijk velen ontgaan, want de bekendmaking en publicatie van complete genomen is welhaast routine geworden. Ook zit er een zekere willekeur in dit soort lijstjes. Genomes OnLine gaat uit van afgesloten genoomprojecten en komt dan uit op 61 archaeabacteriën, 833 eubacteriën en 106 eukaryoten. Als je op soorten ontdubbelt en strengere eisen stelt aan de resolutie van de resultaten, kun je ook op compleet andere genoomaantallen uitkomen. Zo komt het Genome News Network nu op 188 complete gesequenste soorten: 22 archaea, 130 bacteriën en 22 eukaryoten.
Duidelijk is dat einde nog lang niet in zicht is. Er staan nog duizenden microbiële genomen op de rol en honderden genomen van hogere organismen. Zijn we langzamerhand niet een beetje uitgesequenst? Martijn Huynen, hoogleraar Comparative Genomics bij het Nijmegen Centre for Molecular and Biomolecular Informatics, kan zich de vraag wel voorstellen. ‘Ik loop zelf al sinds 1996 in het sequenswereldje mee en een aantal jaren geleden dacht ik ook dat het wel een keer afgelopen zou zijn. Maar nu kijk ik daar toch weer anders tegenaan’, vertelt Huynen. ‘De kwaliteit van de genoominformatie is gewoon erg hoog en een compleet genoom sequensen wordt steeds goedkoper.’
Ook Arjen van Tunen, directeur van het Wageningse biotechbedrijf Keygene, denkt dat de stroomversnelling in het sequensen nog lang niet aan haar limiet zit. ‘De focus ligt al lang niet meer alleen op het sequensen van soorten en modelorganismen. Door de technologische ontwikkelingen wordt het nu ook lucratief om kleinere gewassen als tarwe of prei te gaan sequensen. Of binnen soorten te kijken naar variëteiten of zelfs naar de individuele genetische variatie. We zijn echt nog lang niet uitgesequenst.’
Defect
Huynen wijst er bovendien op dat er ook nog echte gaten zijn. ‘Bij mijn weten is er nog steeds geen reptiel gesequenst. Natuurlijk is het niet zo dat je met twee keer zo veel gesequenste genomen ook over twee keer zo veel informatie beschikt. Maar door het vergelijken van genomen wordt het wel mogelijk hele subtiele informatie boven tafel te krijgen. De genoominformatie levert geen definitieve antwoorden, maar kan je wel heel goed helpen om goede hypotheses te genereren.’
Als voorbeeld noemt Huynen zijn eigen onderzoek naar complex I, een eiwitcomplex uit de oxidatieve fosfylering, dat uit 45 eiwitten bestaat. ‘Bij kinderen met stofwisselingsproblemen in dit complex verwacht je dat die iets te maken hebben met defecten in een van de 45 betrokken genen. Als je daarnaar gaat kijken, blijkt er echter niks mis te zijn met die genen. Blijkbaar gaat het om de assemblage van de eiwitcomplexen. Dat zijn heel geconserveerde processen. Door vergelijkende analyse van genoominformatie van onder meer protozoa en door te analyseren welke genen er co-evolueren met complex I-genen, kun je aanwijzingen vinden hoe het op moleculair niveau geregeld is, en welke eiwitten erbij betrokken zijn.’ Op deze wijze zijn al vier nieuwe assemblagegenen voorspeld en experimenteel bevestigd, vertelt Huynen. ‘Het gaat zelfs zo ver dat we op basis van genoomvergelijking een nieuw gen hebben gevonden, waar we nog geen patiënt bij hebben.’
Door meer genomen met elkaar te vergelijken worden volgens Huynen de hypotheses beter en is het mogelijk specifieker vragen te beantwoorden. De bottleneck is volgens hem de experimentele toetsing. ‘Sequensen wordt steeds goedkoper. Je kunt allerlei genetische verbanden vinden, maar het blijft essentieel deze ook experimenteel te testen.’
Evolutie van het genoomsequensen
Gesequenste organismen
Arabidopsis thaliana (plant) De zandraket was de eerste plant die werd gesequenst, in 2000. Arabidopsis, een lid van de mosterdfamilie, geldt als hét modelorganisme voor plantengenetici. Hij groeit snel, is eenvoudig te kweken en heeft een relatief klein genoom (125 Mb). Inmiddels zijn ook rijst en de populier volledig in kaart gebracht.
Caenorhabditis elegans (nematode) Het ‘complete’ genoom van dit modelaaltje, troeteldier van ontwikkelingsbiologen en kankeronderzoekers, werd gepubliceerd in 1998. Een resterend gat in de sequentie werd echter pas in 2002 opgevuld.
Gallus gallus (vogel) De kip is vooralsnog de enige vogel waarvan het genoom volledig in kaart is gebracht, in 2004. Het was tot vorige maand – toen het rundergenoom werd blootgelegd – ook het eerste gesequenste landbouwhuisdier.
Homo sapiens (zoogdier) Het sequensen van het genoom van de mens werd omgeven door de nodige controverses. In 2000 werden twee onafhankelijke kladversies van het humane genoom gepubliceerd door onderzoekers van het commerciële Celera Genomics en het publieke Human Genome Project. President Bill Clinton en premier Tony Blair mochten het nieuws samen bekendmaken. Drie jaar later verscheen de definitieve versie. Inmiddels zijn er plannen om nog in 2009 duizend complete menselijke genomen te sequensen.
Lactobacillus plantarum (bacterie) De ruim drie miljoen basenparen van deze melkzuurproducerende bacterie zijn in 2003 in kaart gebracht door een volledig Nederlands consortium: het topinstituut Food and Nutrition.
Saccharomyces cerevisiae (schimmel) Bakkergist was het derde organisme en de eerste eukaryoot die compleet is gesequenst. Hiertoe werd in 1989 een consortium opgezet, dat zeven jaar later het complete genoom publiceerde.
De methodes om de basenvolgorde van DNA te bepalen – het sequensen – hebben een revolutionaire ontwikkeling doorgemaakt. De eerste vingeroefeningen werden in het begin van de jaren zeventig uitgevoerd met RNA, omdat dit technisch eenvoudiger was. De Belgische moleculaire bioloog Walter Fiers had in 1971 de primeur de eerste complete nucleotidevolgorde van een gen te ontrafelen: van een RNA-virus, de bacteriofaag MS2. In 1976 beschreef hij het complete genoom van dit virus, een jaar later volgden Britten met het eerste DNA-genoom: van de bacteriofaag Phi-X174.
Het sequensen van DNA was in het begin tijdrovend laboratoriumwerk, voornamelijk gebaseerd op chromatografie. Een belangrijke innovatie was de methode die de Britse onderzoeker Frederick Sanger in 1975 ontwikkelde. Deze Sangermethode – ook wel bekend als chain termination – maakt gebruik van fluorescerende dideoxynucleotidetrifosfaten ofwel ddNTPs. Hierdoor wordt automatisering van de detectie mogelijk. Het DNA wordt hierbij letterlijk in volgorde van begin tot eind gesequenst.
Een nieuwe stroomversnelling ontstond toen de Zweedse biochemicus Pål Nyrén in het begin van de jaren negentig het zogeheten pyrosequensen introduceerde. Hierbij wordt een DNA-streng afgelezen door de synthese van een complementaire streng. Iedere keer dat een nucleotide – A, T, C of G – wordt toegevoegd, resulteert het vrijkomende pyrofosfaat via een enzymatische omzetting in een lichtsignaaltje dat kan worden afgelezen. Door bovendien gebruik te maken van de – reeds in 1983 ontwikkelde – Polymerase Chain Reaction (PCR) was het mogelijk DNA te vermeerderen en vervolgens kenmerkende, korte stukjes te onderzoeken.
Het Amerikaanse bedrijf Celera Genomics, onder leiding van de biochemicus Craig Venter, maakte begin jaren negentig de al langer bestaande Shotgun-methode populair. Bij deze methode wordt het totale genoom in willekeurige en elkaar deels overlappende stukjes gehakt. Die stukjes worden eerst gesequenst en vervolgens aan de hand van computervergelijkingen in de juiste volgorde gezet. Na aanvankelijke aarzeling of de shotgun-methode geschikt is voor complete, complexe genomen won deze snelle methode snel terrein. Bioinformatica en een accurate assemblage zijn hiervoor essentieel.
Sinds 2005 is het sequensen steeds sneller en efficiënter geworden en spreekt men van high-throughput sequencing en ultra high-thoughput sequencing. Hierbij worden parallel duizenden of zelfs miljoenen fragmenten gelijktijdig afgelezen. Bij nog nieuwere sequensmethoden die nog in ontwikkeling zijn, wordt onder meer gebruik gemaakt van microscopie of worden DNA-moleculen door nanoporiën getrokken en daarbij gekarakteriseerd.
Sequensen in jaartallen
1869 De Zwitserse chemicus Johann Friedrich Miescher isoleert uit de celkernen van witte bloedcellen een fosforhoudende stof die hij nucleïne noemt. Deze stof blijkt later desoxyribonucleïnezuur ofwel DNA te zijn, de drager van erfelijke informatie. 1909 De Russich-Amerikaanse biochemicus Phoebus Levine stelt de theorie op dat DNA uit vier nucleotiden – adenine, guanine, thymine en cytosine – bestaat. 1953 Ontdekking van de dubbele helixstructuur van DNA door James Watson en Francis Crick. 1973 Amerikaanse genetici brengen met behulp van plasmiden een kikkergen tot expressie in bacteriële cellen, het eerste experiment met recombinant DNA. Dankzij deze techniek wordt het mogelijk DNA te isoleren uit tal van organismen. 1975 Het eerste complete genoom, van de bacteriofaag φX174, wordt gesequenst. Het enkelstrengs DNA bestaat uit 5386 basen en 11 genen. 1984 De complete DNA-sequentie van het Epstein-Barr virus wordt ontcijferd en beslaat 170 duizend basen. 1989 In Europa wordt een consortium opgezet om het 12,5 Mb grote genoom van bakkersgist, Saccharomyces cerevisiae, te sequensen. 1995 Het eerste genoom van een bacterie, Haemophilus influenzae, is gesequenst. 2003 Het Human Genome Project wordt afgerond. 2009 Het duizendste genoom wordt gesequenst, de bacterie Coryne-bacterium kroppenstedtii DSM 44385