In 2001 is met veel publieke aandacht een historische mijlpaal in de biologie gepresenteerd: de bekendmaking van het complete genoomsequentie van de mens. Deze kan gezien worden als een blauwdruk van het leven, waarin alle informatie aanwezig is die nodig is voor het ontstaan van een mens! Maar, hoe moeten we deze blauwdruk nu (leren) lezen?

Blauwdruk van het leven

Met het humane genoom hebben we nu de blauwdruk in handen waarin alle instructies en bouwstenen gecodeerd staan voor onder andere het ‘bouwen’ van een mens, beginnend met een enkele cel, de bevruchte eicel. Nu wordt echter duidelijk dat we de instructies wel grotendeels kunnen lezen (we kennen het alfabet en kunnen de woorden maken), maar we begrijpen nog maar relatief weinig van de biologische rol van de afzonderlijke onderdelen (we kunnen er vaak nog geen zinnen met een betekenis van maken).

De huidige uitdaging na de bekendmaking van het complete humane genoom is dan ook het interpreteren van de blauwdruk, in biologische termen: het toewijzen van biologische functies aan de informatie in het humane genoom. Zo weten we bijvoorbeeld nog maar van een klein deel van de naar schatting 30 tot 40 duizend gecodeerde genen in het humane genoom wat hun functie is. Het gebruik van modelorganismen en technologieën waarmee gericht genen kunnen worden uitgeschakeld speelt een belangrijke rol in het onderzoek dat zich bezig houdt met het toewijzen van functies aan genen. Dit relatief nieuwe vakgebied wordt ook wel functional genomics genoemd.

Modelorganismen

De afgelopen jaren zijn genoomsequenties, de nagenoeg volledige DNA-volgorde, van diverse organismen beschikbaar gekomen. De genoomsequentie van de mens, maar ook van diverse modelorganismen in het laboratorium worden gebruikt voor onderzoek, zoals de muis en de rondworm Caenorhabdites elegans. Van diverse andere modelorganismen die veel in laboratoria gebruikt worden, zoals de zebravis en de rat, wordt de komende jaren de opheldering van hun genoomsequentie verwacht.

Dergelijke genoomprojecten leveren een enorme hoeveelheid informatie over genen en de bijbehorende eiwitten. Maar toch weten we nog relatief weinig van de biologische functie van deze genen. Bijvoorbeeld het opzienbarende feit dat nagenoeg alle naar schatting 30 tot 40 duizend genen van de mens ook aanwezig zijn in de muis, de rat, of zelfs de zebravis. Op zich lijkt dit verbazingwekkend, maar net als de mens heeft een zebravis ook een hart, dat precies dezelfde functie vervult. In dit licht bezien is het dus eigenlijk helemaal niet vreemd dat ook de volgorde van het DNA in deze organismen nagenoeg hetzelfde is.

Met andere woorden, de DNA-volgorde is evolutionair geconserveerd. Dankzij deze conservering kunnen we dus uitstekend gebruik maken van onderzoek in modelorganismen om uitspraken te doen over de biologische functie van genen in het humane genoom.

Het grote voordeel van het gebruik van modelorganismen is dat deze veel beter toegankelijk zijn voor het functional genomics onderzoek dan de mens zelf. Het is ethisch niet verantwoord om mens mutanten te maken en daarvan het genoom te gaan bestuderen. Verderop in de tekst gaat het over het doelbewust maken van mutanten. Vanuit de medische hoek komen wel wat gegevens vrij over erfelijke aandoeningen en de bijbehorende ‘DNA-foutjes’, maar deze informatie leert ons niet zoveel over de grote lijn van biologische processen die zijn vastgelegd in ons DNA zoals bijvoorbeeld groei, ontwikkeling en veroudering van een cel.

Een van de belangrijkste functional genomics technieken, waarover we bijvoorbeeld voor de muis al geruime tijd beschikken, maakt het mogelijk om gericht genen uit te schakelen door middel van de zogenaamde ‘knock-out’ technologie. Via deze techniek worden knock-out mutanten verkregen. Het principe van deze techniek berust op het inbrengen van een ‘vreemd’ stukje DNA in embryonale stamcellen. Als het betreffende stukje DNA op de juiste plek, precies in het gen dat men wil uitschakelen, terechtkomt, dan wordt hierdoor het gen ‘uitgeknocked’. De betreffende cel moet vervolgens teruggeplaatst worden in een vroege embryo (blastocyst), waarna de embryo’s terug geplaatst dienen te worden in draagmoeders.

Deze methode is vrij bewerkelijk en tot nu toe niet geschikt gebleken voor gebruik in andere organismen dan de muis. Hieronder beschrijven we de ontwikkeling van alternatieve technologie die bovenstaand doel, het uitschakelen van genen om achter hun biologische functie te komen, gemakkelijker uitgevoerd kan worden. Deze techniek is bovendien wel geschikt voor gebruik in andere organismen.

Genen uitschakelen

In organismen kunnen we gericht een gen uitschakelen (zo krijg je knock-out mutanten). De functie van het uitgeschakelde gen kan vervolgens worden achterhaald door het fenotype van de knock-out mutant te bestuderen. In afbeelding 1 staat schematisch weergegeven hoe de procedure in zijn gang gaat.

Als eerste wordt de mannelijke kiembaan (de testis) blootgesteld aan een chemische mutagene stof UNA ( n-ethyl-n-nitrosourea) die fouten veroorzaakt in het DNA van de spermacellen. Als deze gemutageniseerde mannelijke dieren worden gebruikt in een fokprogramma, dan resulteert dit in nakomelingen (de mutanten) met foutjes in hun genoom.

Vervolgens nemen we een DNA monster van alle nakomelingen en bestuderen met behulp van moleculair biologische technieken precies dat stukje DNA waar de informatie ligt voor het gen dat je wilt uitschakelen. We zoeken dan naar mutaties in het DNA die opgetreden zijn als gevolg van de chemische behandeling. Het chemische stofje dat we gebruiken brengt vrij subtiele veranderingen aan in het DNA. Het kan letters veranderen in het DNA alfabet en daarmee de codering veranderen.

Zoals eerder gezegd kan het chemische stofje dat we gebruiken de letters in het DNA veranderen. Waar dus eerst bijvoorbeeld GGA stond, de instructie om het aminozuur glycine in te bouwen, kan na mutagenese de code TGA zijn ontstaan een stopcodon. Met als gevolg dat de matrijs om het eiwit te krijgen zodanig veranderd is dat er geen volledig eiwit gevormd wordt. En dan hebben we dus ons doel bereikt: het gen dat codeert voor een specifieke matrijs, is chemisch beschadigd en daarmee is het product functioneel uitgeschakeld.

Deze benadering klinkt erg simpel en is dat experimenteel ook, maar er moeten wel DNA samples van veel dieren bekeken worden. Het gaat hier om zo’n 1000 tot 3000 dieren. Dit lijken veel dieren, maar deze dieren kunnen wel steeds opnieuw gebruikt/gescreend worden voor mutaties in andere genen. Verder is het mede dankzij de recente ontwikkelingen op het gebied van parallellisatie van moleculair biologische technologieën en de mogelijkheden tot het inzetten van robots (zie afbeelding 2), die verregaande automatisering van het proces toelaten, dat bovenstaande benadering ook daadwerkelijk in de praktijk mogelijk is geworden.

Samengevat komt onze benadering er op neer dat we met een hagelgeweer op de genetische informatie, het DNA, schieten dat in het sperma (waaruit de mutanten zullen ontwikkelen) ligt opgeslagen. Dit resulteert in een heleboel willekeurige DNA-schade, die in ieder dier weer anders is. Vervolgens gaan we op zoek naar de speld in de hooiberg: met een moleculair vergrootglas kijken we naar een specifieke plek in het DNA, daar waar de eigenschap ligt gecodeerd waarin we zijn geïnteresseerd en bekijken of er daar toevallig iets geraakt is.

De volgende stap is natuurlijk het bestuderen van het dier waarin een specifiek gen is uitgeschakeld. Meestal weten we al iets van het gen voordat we het gaan uitschakelen. We hebben dus al een vermoeden waar we moeten gaan zoeken naar afwijkingen, ook als deze niet meteen duidelijk zijn waar te nemen. Als we het effect van het uitgeschakelde gen uiteindelijk kunnen koppelen aan een verandering in het organisme (fenotype), dan kunnen we dus een biologische functie toewijzen aan dit gen. Als we dan te maken hebben met een evolutionair geconserveerd gen dan hebben we gelijk de functie van de menselijke variant van dit gen te pakken.

Wij hebben bovenstaande techniek opgezet en kunnen nu gericht genen uitschakelen in nagenoeg ieder organisme naar keuze. We hebben deze methodologie momenteel succesvol geïmplementeerd voor zowel zebravis ( Danio rerio) als ook de rondworm <I.Caenorhabdites elegans en werken aan de ontwikkeling van deze techniek voor de muis en de rat (zie afbeelding 3).

Al deze modelorganismen hebben specifieke eigenschappen die ze geschikt maken voor verschillende typen onderzoek met betrekking tot humane ziekten en gezondheid. Zo kan in de zebravis uitstekend de vroege embryonale ontwikkeling bestudeerd worden, omdat dat proces geheel buiten de moeder gebeurt. Daar komt nog eens bij dat een zebravis embryo volledig transparant is. Na ongeveer 7 dagen kun je gewoon onder de microscoop zelfs een hart zien kloppen, dat bloed rondpompt. Echter, een zebravis is niet geschikt om gedragsstudies, bijvoorbeeld met betrekking tot verslaving of schizofrenie, uit te voeren. Hiervoor is de rat weer wel prima te gebruiken.

Verschillend onderzoek vraagt dus het gebruik van verschillende model systemen en het is dus van belang dat voor ieder systeem de gereedschapskist goed gevuld is, en de knock-out technologie is een zeer krachtige techniek die zeker niet mag ontbreken.

Bronnen:

Wienholds E, Schulte-Merker S, Walderich B, Plasterk RH. Target-selected inactivation of the zebrafish rag1 gene. Science 297(2002):99-102

Colbert, Till, Tompa, Reynolds, Steine, Yeung, McCallum, Comai, and Henikoff. High-throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology (2001): 126(2):480-4