Je leest:

Erytropoëtine, wel of niet aantoonbaar bij dopingcontrole?

Erytropoëtine, wel of niet aantoonbaar bij dopingcontrole?

Auteur: | 30 september 2001

Begin augustus keurde de medische commissie van het Internationaal Olympisch Comité twee nieuwe EPO-testen goed. Zowel Franse als Australische onderzoekers ontwikkelden een test die de aanwezigheid van kunstmatig EPO kan aantonen. Dat is nog niet voldoende: voor de Olympische Spelen moet nog blijken of deze testen juridisch acceptabel zijn.

De Tour de France werd in 1998 opgeschrikt vanwege de onthulling over het misbruik van EPO. Ingewijden vermoedden al langer dat er in het wielerpeloton sprake was van EPO-misbruik, maar de omvang van het probleem was voor menigeen een ontluisterende ervaring. Erytropoëtine, zoals het eiwit met de naam EPO eigenlijk heet, dankt zijn populariteit niet alleen aan zijn effectiviteit om de sportprestatie te verbeteren. Lange tijd ontbrak namelijk een adequate detectiemethode. Twee meettechnieken lijken nu net op tijd voor de Olympische Spelen klaar om doping met EPO te bewijzen.

De Tour de France werd in 1998 opgeschrikt door EPO-misbruik.

EPO is een peptidehormoon. Het speelt een belangrijke rol bij de fysiologische huishouding van bloed. Het meeste EPO ontstaat in de nieren, als een prohormoon. Pas nadat een enzym daar een peptideketen van 27 aminozuren afhaalt, heeft het zijn uiteindelijke, actieve vorm. Erytropoëtine regelt de aanmaak van rode bloedcellen in het beenmerg. Is bijvoorbeeld de zuurstofspanning in de lucht laag, dan vormt het lichaam meer erytropoëtine. Dat stimuleert de rijping van rode bloedcellen in het beenmerg. Meer rode bloedcellen betekent vervolgens meer capaciteit voor zuurstoftransport. Zo compenseert het lichaam voor het zuurstoftekort.

Als de nieren slecht of niet functioneren, dan kan door een chronisch erytropoëtinetekort ernstige bloedarmoede ontstaan. Dat treedt op bij chronische nierinsufficiëntie van dialysepatiënten, bij predialysepatiënten en bij kankerpatiënten waarbij medicijnen de nierfunctie aantasten. Toediening van erytropoëtine van buitenaf kan dan de bloedarmoede tegengaan.

Het recombinant-DNA-biotechnologie importeerden farmaceutische bedrijven in de jaren tachtig menselijk DNA dat codeert voor erytropoëtine in het DNA van bepaalde zoogdiercellen. Deze cellen produceerden daarop een variant van het menselijke erytropoëtine, namelijk recombinant humaan erytropoiëtine (rhEPO). In grootschalige celkweken konden ze rhEPO in commercieel verantwoorde hoeveelheden produceren.

Sindsdien misbruiken sommige sporters dit rhEPO. Het verhoogt immers kunstmatig de capaciteit voor zuurstoftransport en verbetert zo hun sportprestatie. Het misbruik wordt met name geassocieerd met duursporten, zoals duurlopen en wielrennen op de weg.

Dopinggeduide middelen en methoden

I. Hoofdgroepen van dopinggeduide middelen

A) Stimulantia B) Narcotische analgetica C) Anabole middelen 1) Anabole androgenen 2) b2-agonisten D) Diuretica E) Peptidehormonen, mimetica en analoga en verwante verbindingen

II. Dopingmethoden

A) Bloeddoping B) Toediening van kunstmatige zuurstof dragers of plasmavolume vergroters C) Farmacologische, chemische en fysieke manipulaties

* III. Groepen van dopinggeduide middelen, waarvan het gebruik aan restricties is gebonden* A) Ethanol B) Cannabinoïden C) Lokale pijnstillers D) Glucocorticosteroïden E) Bètablokkerende middelen en alle verwante verbindingen

Dopinglijst

Omdat sporters rhEPO kunnen misbruiken, plaatsten sportorganisaties het in 1990 op de lijst van verboden middelen. De belangrijkste lijst van dopinggeduide middelen en methoden is die van het Internationaal Olympisch Comité Op deze lijst valt rhEPO onder de I.E. peptidehormonen, mimetica en analoga.

Bloeddoping noemt men vaak in een adem met erytropoëtinegebruik en deze twee technieken worden nogal eens ten onrechte verward. Bij bloeddoping dient men intraveneus, via een infuus, bloed toe zodat het aantal rode bloedcellen kunstmatig toeneemt. Vanwege de ernstige complicaties die daarbij kunnen optreden, mogen we er vanuitgaan dat bloeddoping vervangen is door rhEPO-gebruik.

Weliswaar kan een lijst vele verboden middelen noemen, maar als je het niet kunt aantonen, kun je een verbod moeilijk hardmaken. Wie met een analyse misbruik van dopinggeduide middelen wil aantonen, moet allereerst kiezen voor het biologisch materiaal waarin dergelijke middelen meetbaar zijn. Afhankelijk van de analytische strategie zijn voor het aantonen van rhEPO zowel urine als bloed geschikt. Deze lichaamsvloeistoffen hebben beide hun voor- en nadelen.

Urineren onder toezicht

Sinds de jaren zestig gebruiken laboratoria voor dopingcontroles enkel urinemonsters om de klassieke dopinggeduide middelen te vinden. Het grootste voordeel van urine is dat daarin middelen in relatief hoge concentraties voorkomen. Dat maakt eventueel gebruik eenvoudig aantoonbaar. Een nadeel is dat wie kwaad wil, gemakkelijk met urine kan frauderen of andere manipulaties kan uitvoeren. De daardoor ontstane huidige afnameprocedure van urine kun je als een ingrijpende inbreuk op iemands privéleven bestempelen. Het is geen pretje als je moet urineren onder strikt toezicht. Vergeleken met bloedafname is zo’n urineafname echter weinig belastend voor het lichaam.

Dopingonderzoekers krijgen desondanks steeds meer de belangstelling voor bloed. In sommige gevallen vormt bloed zelfs het enige biologische materiaal waarmee je het gebruik van bepaalde dopinggeduide middelen of methoden kunt aantonen. Het menselijk lichaam scheidt sommige middelen namelijk niet via de urine uit, ook niet na omzetting in andere verbindingen. Met een analyse van een urinemonster kom je dan nergens. Bloed kent echter ook beperkingen. De mogelijke omvang van een bloedmonster is maar beperkt en het hanteren daarvan vereist speciale voorzorgsmaatregelen. Bovendien zijn er enkele juridische beperkingen, aangezien sommige mensen om religieuze redenen mogen weigeren bloed af te staan. Voor de dopingcontrole zal bloed in het algemeen urine nooit helemaal kunnen vervangen. Daarom kunnen we beter stellen dat urine en bloed elkaar qua mogelijkheden aanvullen.

De internationale wielerorganisatie Union Cycliste Internationale (UCI) heeft inmiddels bloedtesten ingevoerd. Bij deze testen meten dopinglaboratoria de hematocrietwaarde. De ICU voerde deze testen in naar aanleiding van de aanhoudende geruchtenstroom dat wielrenners op grote schaal rhEPO gebruiken. Ze hebben louter een medische betekenis, omdat de opzet geen dopingcontrole is. Bovendien kan men een eventuele verhoging van de hematocrietwaarde beïnvloeden. De directe invloed van deze test op het tegengaan van rhEPO-gebruik is dan ook nihil.

Hematocriet

Verhouding van het volume van alle rode bloedcellen samen tot het totale bloedvolume. Als deze bij professionele wielrenners groter is dan de limietwaarde (weten 0,50) dan moet een renner tijdelijk zijn wedstrijdlicentie inleveren. Renners mogen dan om gezondheidsredenen een aantal weken niet in wedstrijden uitkomen. Pas nadat zij kunnen aantonen weer ‘gezond’ te zijn, dat wil zeggen normale hematocrietwaarden hebben, mogen de renners weer starten. Aangezien rhEPO-gebruik leidt tot een toename van de hematocriet, vormt de hematocrietwaarde een mogelijke parameter die wijst op het gebruik van rhEPO.

Deze parameter is echter niet ondubbelzinnig. Andere factoren kunnen namelijk de hematocrietwaarde verhogen of verlagen. Ook zijn er grote verschillen in de waarden van sporters en kan hij bij een sporter schommelen. Een enkele gemeten waarde van een individu ten opzichte van een referentiewaardengebied van meer individuen vormt daarom slechts een beperkte indicatie. Aan een hematocrietwaarde kan daardoor enkel een medisch bindend advies verbonden worden en geen juridische sanctie.

Analyse techniek

Voor de juiste analytische strategie speelt de keuze van meettechnieken een belangrijke rol. We moeten in de dopinglaboratoria met name met de juridische toetsbaarheid van deze technieken rekening houden. Het analytische bewijs moet immers ondubbelzinnig zijn. Massaspectrometrie is vooralsnog de enige chemische analysetechniek, een enkele uitzondering daargelaten, die reglementair wordt erkend voor een uiteindelijke identificatie. Voor rhEPO ligt daar nu het grootste probleem. Met de huidige stand der techniek behalen we met de routinematige massaspectrometrie de vereiste gevoeligheid niet.

Op dit moment zijn er twee strategieën voor een alternatieve aanpak, te weten directe en indirecte detectiemethoden. De twee mogelijk op de Olympische Spelen inzetbare technieken illustreren beide strategieën. Bij de directe methode, zoals ontwikkeld in Frankrijk, moeten we in biologisch materiaal het rhEPO zelf aantonen. Bij de indirecte methode, zoals vervolmaakt in Australië, gebeurt dat via aan rhEPO gerelateerde kenmerken van het bloed.

Het recombinante erytropoëtine en het lichaamseigen eiwit hebben een identiek peptidegedeelte, bestaande uit 165 aminozuren. Toch verschillen het lichaamseigen erytropoëtine en het recombinante menselijke erytropoëtine. Het hormoon is namelijk een glycoproteïne, waarbij suikerketens aan het eiwit vastzitten. De zoogdiercellen in de kweek hechten andere suikerketens aan het eiwit dan in het menselijk lichaam gebeurt. De samenstelling van dat suikergedeelte kan sterk variëren. Dat veroorzaakt een aanzienlijke verscheidenheid in erytropoëtine-structuren. Voor de fysiologische werking maakt dat weinig uit, maar voor de chemische analyse in het dopinglaboratorium is dat een significant verschil.

Directe methode

Het enige verschil tussen rhEPO en natuurlijk erytropoëtine vormen dus de aangehechte suikerketens. Dat kunnen we aangrijpen om een directe methode op te zetten die erytropoëtinegebruik detecteert. Zweedse onderzoekers, onder leiding van Wide, ondernamen vijf jaar geleden een eerste succesvolle poging. Zij gebruikten kolomelektroforese om de twee vormen van erytropoëtine van elkaar te scheiden. Het recombinante eiwit is minder negatief geladen. Daardoor beweegt het in een elektrisch veld trager door de scheidingskolom. De scheiding was weliswaar niet perfect, maar afdoende om na de scheiding beide vormen in verschillende porties te verzamelen. Vervolgens bepaalden ze in die porties de totale hoeveelheid van rhEPO en erytropoëtine met antilichamen die hechten aan erytropoëtine in het algemeen. Dit leidde uiteindelijk tot een profiel dat eventueel aangaf of rhEPO gebruikt was. De Zweedse methode is geschikt voor zowel bloed als urine.

Voorjaar 2000 presenteerde een Franse groep een verbeterde methode voor de detectie van rhEPO in urine (Lasne en De Ceaurriz). Door middel van gel-elektroforese hebben de Fransen de scheiding tussen het natuurlijke en het recombinante erytropoëtine geoptimaliseerd. De methode is zo gevoelig, dat die zelfs binnen beide vormen nog verscheidene subvormen onderscheidt. Na detectie met antilichamen gericht tegen erytropoëtine in het algemeen, leidt dit tot een meer verfijnd profiel. Deze verbeterde methode is nog niet volledig gevalideerd en werd daarom nog niet in de Tour de France van 2000 toegepast.

Omdat juridisch gezien identificaties gebaseerd op detectie met antilichamen bij voorbaat aangevochten kunnen worden, is er nog wel enig onderzoek nodig om de betrouwbaarheid van dergelijke methoden te bewijzen. Bij de Tour de France in 2001 zal de Franse methode naar verwachting wel gevalideerd en operationeel zijn.

Statistiek van doping

De toekomst voor de detectie van rhEPO zit mogelijk in capillaire elektroforese met massaspectrometrische detectie. Met name dan zal het analytische bewijs ondubbelzinniger zijn en kan het naar verwachting de juridische toetsbaarheid beter doorstaan.

Bij de indirecte methode om erytropoëtinegebruik te detecteren, bepaal je enkele hematologische parameters in het bloed. Naast onder andere hematocriet en de concentratie van hemoglobine, zijn dat de hoeveelheden opgeloste transferrine-receptor en erytropoëtine zelf. In 1999 publiceerde een Canadese onderzoeksgroep deze indirecte methode. Met het oog op de Olympische Spelen Sydney 2000 werkt een Australische groep onderzoekers deze indirecte methode verder uit. Met rekenkundige modellen berekent deze methode statistisch significante verschillen tussen gebruikers en niet-gebruikers van rhEPO. Een gebruiker wordt dan op basis van een kansberekening ten opzichte van diverse parameters veroordeeld.

Juridisch gezien ligt een dergelijke overtredingsindicator ingewikkelder dan bijvoorbeeld de overschrijding van een bepaalde grenswaarde. De directe methode met zijn ondubbelzinnige analytische bewijs biedt daarom waarschijnlijk meer kans op succes dan de indirecte. Bij indirecte methoden zullen sporters bovendien sneller een beroep doen op uitzonderingsituaties, zeker als het gaat om hun hematologische parameters.

Al met al is het misbruik van rhEPO in de sport op dit moment niet adequaat aantoonbaar. In de aanloop naar de belangrijke sportevenementen van dit jaar zijn echter belangrijke chemisch-analytische vorderingen gemaakt. Een werkelijk betrouwbare en ondubbelzinnige erotyropoëtinetest lijkt daarom een kwestie van tijd. Hopelijk heeft het IOC als u dit leest een beslissing genomen over de juridische waarde van de twee nieuwe EPO-testen.

Literatuur

Dit artikel is een publicatie van Natuurwetenschap & Techniek.
© Natuurwetenschap & Techniek, alle rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 30 september 2001

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.