Omdat de cellen van de embryoblast pluripotent zijn, zullen de gekweekte cellen in het kweekbakje ook pluripotent zijn. Op deze manier kunnen er dus in vitro van een paar pluripotente cellen, een heleboel pluripotente cellen gemaakt worden. Omdat de cellen pluripotent zijn, kunnen ze nog differentiëren tot ieder celtype dat in het lichaam voorkomt. Het zijn deze eigenschapen die embryonale stamcellen zo bijzonder maken en waardoor ze nuttig kunnen zijn voor de medische wetenschap.
In 1981 is het voor het eerst gelukt om embryonale stamcellen afkomstig van muizenembryo’s te kweken. Twee onafhankelijke onderzoeksgroepen, één in de Verenigde Staten en één in het Verenigd Koninkrijk, presenteerden in hetzelfde jaar hun resultaten. De embryoblast van blastocysten werd geïsoleerd en in kweekschaaltjes geplaatst. De cellen groeiden en deelden, en vormden steeds groter wordende kolonies van cellen. Wanneer de kolonies te groot dreigden te worden, werd een klein gedeelte overgebracht in een nieuw schaaltje, het zogenaamde passeren. Op deze manier werden de cellen gedurende honderden passages gekweekt om te bewijzen dat de cellen niet differentieerden. Want als deze cellen inderdaad oneindig zouden kunnen delen (self-renewal) dan zouden ze zelfs na honderden passages nog pluripotent moeten zijn.
Hoe je pluripotentie kunt bewijzen
Het is niet eenvoudig om pluripotentie van cellen aan te tonen. Eén methode is bijvoorbeeld het veranderen van het medium waarin de cellen gekweekt worden. Door het toevoegen van signaalstoffen zoals hormonen of cytokines kan de differentiatie naar bepaalde celtypen gestimuleerd worden. De identiteit van de gevormde cellen kan vervolgens worden onderzocht, en als er cellen van de drie verschillende kiembladen gevormd worden, is dit een aanwijzing dat de cellen pluripotent zijn. Het is echter geen absoluut bewijs dat uit deze cellen ook alle celtypen kunnen ontstaan. Het is bijna ondoenlijk om de cellen in een kweekschaaltje te laten differentiëren naar alle meer dan 200 celtypen die in het lichaam voorkomen. Bovendien is het moeilijk om de verschillende celtypen te identificeren. Sommige cellen hebben een karakteristieke morfologie zoals zenuwcellen, maar het is lastig om aan te tonen dat deze cellen daadwerkelijk functioneel zijn.
Een andere methode om pluripotentie van cellen aan te tonen, is om de cellen in te brengen in een muis met een verminderd afweersysteem. Als de cellen inderdaad pluripotent zijn, zullen ze in de muis een teratoom vormen en differentiëren. Een teratoom is een tumor die ontstaat uit ongedifferentieerde (stam)cellen. De tumor kan geanalyseerd worden en wanneer deze celtypen van de drie kiemlagen bevat, dan is dit een aanwijzing dat de cellen die de tumor vormden pluripotent waren. Ook hier is het vrijwel onmogelijk om te bewijzen dat de stamcellen echt alle voorkomende celtypen kunnen vormen. Bij deze methode is het verder belangrijk dat aangetoond wordt dat het teratoom inderdaad gevormd is uit de ingebrachte cellen, en niet gevormd door de muis zelf. Dat kan namelijk ook voorkomen.
Het meest overtuigende bewijs van pluripotentie van cellen wordt daarom geleverd door het maken van een zogenaamde chimeer. Hierbij worden stamcellen afkomstig van het ene dier ingespoten in een blastocyst (embryostadium) van het andere dier. Wanneer de embryonale stamcellen bijvoorbeeld oorspronkelijk afkomstig waren van een albinomuis is het slim de cellen in een blastocyst te spuiten van een muis met een bruine vacht. De pluripotente cellen gaan deel uit maken van de embryoblast, die nu uit twee celtypen bestaat: dit is een chimeer. Het gevormde chimere embryo kan vervolgens in de baarmoeder van een schijnzwangere muis worden gebracht en na een aantal weken zal er een pup geboren worden bestaande uit twee celtypen. Aan het dier is dit direct aan de vachtkleur te zien: de witte delen zijn afkomstig van de pluripotente stamcellen, de bruine delen van het oorspronkelijke embryo. Het kan voorkomen dat vrijwel de gehele muis gevormd is uit de stamcellen en slechts een klein percentage uit het oorspronkelijke embryo. Als deze muis normaal is en geen afwijkingen vertoont, bewijst dit dat de stamcellen niet alleen alle cellen kunnen vormen van de muis, maar ook dat deze cellen functioneel zijn. Door de chimere muizen te kruisen en te onderzoeken of er zich geheel witte muizen onder de nakomelingen bevinden, kan men aantonen dat de stamcellen zelfs nieuwe geslachtscellen hebben geproduceerd. Dit wordt gezien als het ultieme bewijs van pluripotentie!
Hoe kweek je stamcellen?
Stamcellen kunnen, net als gewone cellen, worden gekweekt in kweekflessen of kweekschalen van plastic. Om de cellen van voedingstoffen, zoals suikers en aminozuren, te voorzien, gebruiken onderzoekers een fysiologische zoutoplossing die dezelfde osmotische waarde heeft als de cellen. Deze vloeistof met voedingstoffen is niet alleen geschikt voor het kweken van stamcellen, maar ook voor de kweek van bacteriën en schimmels. Het is daarom belangrijk dat het kweekmedium en de flessen en schalen steriel zijn; met andere woorden vrij van bacteriën en schimmels.
Om besmetting met deze organismen tegen te gaan moet er onder steriele omstandigheden worden gewerkt. Daarvoor gebruiken onderzoekers een microbiologische veiligheidskast, ook wel ‘flowkast’ genoemd. Dit is een halfopen kast waar de lucht eerst door een filter wordt geblazen, zodat in de kast een steriele luchtstroom ontstaat. Het filter houdt alle deeltjes met een diameter van 0,3 micrometer of groter tegen. Binnenin de flowkast kunnen flessen en schalen geopend worden zonder dat ze besmet raken met bacteriën of schimmels.
Petrischaal met stamcellen die vloeibaar medium krijgen toegediend.
Shutterstock, Biowetenschappen en maatschappij
(Stam)cellen kunnen vers worden geïsoleerd maar ook jarenlang in bevroren toestand worden bewaard in vloeibare stikstof. Stamcellen, vers of ontdooid, worden met een steriele pipet samen met een paar milliliter kweekmedium in een fles gebracht. De fles wordt in een broedstoof geplaatst, die cellen op lichaamstemperatuur van 37 graden Celsius houdt en waar een hoog vochtigheidspercentage heerst, zodat het weinige vocht in de fles niet te veel verdampt. De meeste cellen zullen zich hechten aan de bodem van de fles en vormen een laag van één enkele cel dik. Sommige celtypes kunnen kleine kolonies vormen. Door de temperatuur en de voedingsstoffen gaan de cellen groeien en zich vermenigvuldigen, ze prolifereren. De cellen scheiden daarbij afvalstoffen uit die ervoor zorgen dat het kweekmedium steeds zuurder wordt. Om dit enigszins tegen te gaan, bevat het medium ook een pH-buffer. Als het medium te zuur is geworden of de voedingsstoffen op zijn, moet het medium vervangen worden.
Als de cellen goed groeien en zich vermenigvuldigen, zal de kweekfles op een gegeven moment te klein worden. De cellen kunnen namelijk niet bovenop elkaar groeien, omdat ze dan te weinig zuurstof krijgen en dood gaan. Wanneer de bodem van de kweekfles bijna volledig bedekt is, worden de cellen via een enzymatische behandeling losgemaakt en wordt een deel van de cellen overgebracht naar een nieuwe fles, waar ze weer de ruimte hebben en kunnen prolifereren. De cellen die ‘over’ zijn, worden of weggedaan of ze kunnen worden ingevroren voor later gebruik.
Knock-out muizen maken
Buiten het feit dat embryonale stamcellen pluripotent zijn, hebben ze nog een eigenschap die nuttig is gebleken voor de biomedische wetenschap, met name om de functie van genen te achterhalen. In deze cellen vindt namelijk homologe recombinatie redelijk efficiënt plaats. Homologe recombinatie is het proces waarbij overeenkomstige (homologe) stukken DNA van het chromosoom worden uitgewisseld. Normaal gesproken vindt dit alleen plaats in eicellen en spermacellen aan het begin van de reductiedeling, waarbij stukken chromosoom in de chromosoomparen worden uitgewisseld (recombinatie).
In embryonale stamcellen kan dit proces worden benut door stukken DNA in het kweekmedium te brengen die homoloog zijn aan een bepaald gen, maar waarin een belangrijk onderdeel ontbreekt, bijvoorbeeld de startsequentie om het gen af te lezen. Wanneer het betreffende gen is vervangen door het nieuwe stukje DNA zonder startsequentie zal bij verdere groei en celdeling een kolonie stamcellen ontstaan waarin dit gen niet gebruikt wordt. Maar omdat deze cellen nog altijd pluripotent zijn, kunnen ze na inbrenging in een blastocyst een chimere muis maken. Door te kruisen met deze chimere muis kan er tussen de nakomelingen een muis zitten waarbij in alle cellen het betreffende gen defect is. Dit wordt een knock-outmuis genoemd. Om de functie van het gen te achterhalen, hoeft de muis alleen maar vergeleken te worden met nestgenoten bij wie het gen gewoon werkt. Op deze wijze is de functie van honderden genen achterhaald. Zo heeft een knock-outmuis van het myostatinegen bijvoorbeeld weinig vet maar zeer geprononceerde spieren. Daardoor weten we dat dit gen zorgt voor remming van spierontwikkeling. Hetzelfde is er aan de hand bij de dikbilkoeien (Belgisch witblauw). Ook bij deze dieren is er een mutatie in het myostatinegen. Maar bij deze dieren is de mutatie ontstaan op ‘natuurlijke’ wijze door normale kruisingen tussen verschillende rassen.
Nadat het in 1981 was gelukt om embryonale stamcellen van een muis te kweken, hebben veel onderzoekers geprobeerd om embryonale stamcellen van andere diersoorten te kweken. Voorbeelden daarvan zijn het rund, varken, hond en konijn. Dit bleek echter vooralsnog tevergeefs. Het probleem is dat de embryonale cellen van deze dieren wel gaan differentiëren, en daarmee hun pluripotentie verliezen en ook nog stoppen met delen. Toch slaagden Amerikaanse onderzoekers zeventien jaar later, in 1998, erin om voor het eerst humane embryonale stamcellen te kweken. Hiervoor werden embryo’s gebruikt die ingevroren waren na een reageerbuisbevruchting en niet werden teruggeplaatst in de vrouw, bijvoorbeeld omdat de kinderwens al was vervuld.