Je leest:

Eiwitten ontrafelen via nevel, gas en vacuüm

Eiwitten ontrafelen via nevel, gas en vacuüm

Auteur: | 8 april 2000

Proteomics – het in kaart brengen van de alle eiwitten in een cel – is het logische gevolg op de immer aanzwellende stroom genoomkaarten. Massaspectrometrie is de techniek die daarin een sleutelrol gaat vervullen.

‘Massaspectrometrie is de enige techniek die gevoelig genoeg is om op zeer kleine hoeveelheden eiwit analyses te doen en de identiteit te bepalen. Picomolen van een eiwit zijn al voldoende’, zegt prof. dr. Albert Heck, hoofd van de vakgroep Biomoleculaire Massaspectrometrie van de Universiteit Utrecht.

‘Er is door de universiteit echt gekozen om flink te investeren in massaspectrometrie’, vertelt Heck. ‘En een jaar geleden besloot bovendien de door NWO erkende toponderzoeksschool Centre for biomedical genetics al haar massaspectrometrische onderzoek bij onze groep onder te brengen. Zodoende hebben we nu zes state of the art apparaten in bedrijf.’

Duizenden eiwitvlekjes

De keuze van Utrecht is illustratief voor de stille opmars van de massaspectrometrie. Voorheen was de techniek een ‘service-onderdeel’, dat in Utrecht bij de faculteit Scheikunde was ondergebracht. Sinds september 1998 is het een zelfstandige onderzoeksgroep, met twintig medewerkers en chemicus Heck aan het hoofd. Massaspectrometrie zal naar verwachting in korte tijd uitgroeien tot een nieuwe hype in het moleculair biologisch onderzoek, vergelijkbaar met DNA-chips de voorbije twee jaar.

Proteomics is overigens meer dan massaspectrometrie. Het begint met tweedimensionale eiwitgels, waarin alle eiwitten uit een weefsel worden gescheiden op massa en lading. Na kleuring resulteert dat in een gel met vlekjes en vegen. Duizenden eiwitspotjes vertegenwoordigen het gehele proteoom van dat weefsel.

‘Vervolgens snijden we een spotje uit de gel en behandelen die met een protease-trypsine bijvoorbeeld – die alleen tussen specifieke aminozuren eiwitten doorknipt.’ Het mengsel van eiwitfragmenten (peptides) wordt in de massaspectrometer geanalyseerd. Simpel gesteld komt het er op neer dat de peptides in het apparaat in gasfase worden gebracht, waarbij ze tegelijkertijd een lading krijgen.

Vervolgens vliegen ze door een vacuüm in de spectrometer naar de detector. De verhouding tussen massa en lading bepaalt de ‘vliegtijd’ en ieder peptide komt daardoor netjes op soort gescheiden bij de detector aan. Het resultaat is een reeks piekjes op het computerscherm.

Fragmentatiespectrum

Heck: ‘De massa’s die je meet kan je vervolgens vergelijken met massa’s uit een database. Als je bijvoorbeeld werkt met menselijke weefsels, kan je berekenen welke eiwitfragmenten het menselijk proteoom in theorie moet opleveren na behandeling met trypsine.’

Die theoretische massa’s kunnen al een goede aanwijzing geven welk eiwit het onbekende vlekje is, maar soms levert het tientallen mogelijke kandidaten. Ook dan biedt de massaspectrometer uitkomst, want het apparaat kan één van de peptides verder versplinteren. Dat fragmentatiespectrum levert informatie over de aminozuurvolgorde en daarmee kan het zoeken in de database nog verder worden toegespitst. Deze methode wordt tandem massaspectrometrie genoemd, omdat het twee analysestappen tegelijk worden uitgevoerd.

Niet alleen eiwitidentificatie behoort tot de mogelijkheden, ook subtiele biologische processen zijn zo te onderzoeken, legt Heck uit. ‘Soms zie je op de gel een soort treintje van eiwitspotjes naast elkaar. Die hebben dan hetzelfde molecuulgewicht, maar een verschillende lading. Dat zijn aanwijzing dat een eiwit van fosforgroepen of suikerketens wordt voorzien. Dat soort processen kan je niet aflezen aan het DNA of detecteren met DNA-chips. Juist die modificaties, zoals fosforylering in signaaltransductie, dat is de biologie. Die processen kunnen we nu gaan volgen.’

Tandem massaspectometrie © Bionieuws, Frank Bierkenz / Arno van ’t Hoog, 2000

Wereldrecord eiwitwegen

Het identificeren van eiwitten met massaspectrometrie gaat de komende jaren een belangrijke plaats opeisen. Eind maart maakte Celera, het bedrijf van genoomcruncher Craig Venter, bekend stevig in te zetten op proteomics.

Dat ging gepaard met de voor Venter kenmerkende financiële grootsheid. Het leeuwendeel van de bijna twee miljard gulden die het bedrijf met een recente aandelenemissie ophaalde, gaat naar een nieuwe proteomicsfaciliteit met high throughput massaspectrometers. Daarbij wordt ook veel geld uitgetrokken voor robotisering. Het handmatig uitsnijden van gelblokjes en de monstervoorbereiding staan geautomatiseerde massaspectrometrie in de weg.

Heck blikt naast proteomics naar nog nieuwere toepassingen voor de massaspectrometer. Het resultaat daarvan is onder meer dat zijn groep samen met collega’s uit Wageningen wereldrecordhouder eiwitwegen is geworden. De onderzoekers wisten een enzymcomplex van vanillyl-alcohol oxidase van ruim een miljoen Dalton nauwkeurig te meten.

Alles in de gasfase

Tot zo’n tien jaar geleden konden alleen vluchtige stoffen in gasfase worden gebracht – de voorwaarde om molecuulgewichten met de massaspectrometer te bepalen. Verwarmen is een goede methode om stoffen vluchtig te maken, maar voor enzymen is dat uit den boze, omdat ze dan uit elkaar vallen. Met de electrospraymethode lukt dat nu wel. Een eiwitoplossing wordt met een electrospray in een zeer fijne nevel uiteengeblazen en tegelijkertijd van lading voorzien. Zodra de deeltjes de massaspectrometer ingaan is al het water verdwenen en kan de massa worden bepaald (zie infografiek).

‘We kunnen nu vrijwel alles in de gasfase brengen’, zegt Heck. ‘Dat is het voordeel van electrospray. Het is een hele zachte methode en als er een interactie is, bijvoorbeeld tussen eiwitten, dan kunnen we die intact naar de gasfase brengen en meten. Daar is ook het wereldrecord uit ontstaan. Ik wilde wel eens zien wat de bovengrens is van wat je in gastoestand kan brengen. Het idee dat zo’n groot molecuul door de massaspectrometer vliegt, dat fascineert me.’

Een ander aansprekend voorbeeld daarvan is de interactie tussen enzymen en inhibitors, remmers van enzymactiviteit. Normaal gesproken is het opmeten van de remmende werking een tijdrovende klus, waarbij van verschillende concentraties inhibitor de werking op het enzym wordt bepaald. De massaspectrometer geeft binnen enkele minuten inzicht in de affiniteit van een remmer voor een enzym.

Electrospray is zacht voor grote eiwitten © Bionieuws, Frank Bierkenz / Arno van ’t hoog 2000

Eiwitten doodmaken

Volgens Heck is de standaardmethode om inhibitoractiviteit te meten deels te vervangen door een massaspectrometrische aanpak. ‘Maar dat is nog een controversieel onderwerp. Tijdens het meten vernietig je het enzym. De pieken die je op het scherm ziet vertegenwoordigen geen enkele activiteit meer en dat is voor velen een vreemd idee. Ik zeg wel eens: we maken eiwitten dood, maar we doen een post mortem als het lijk nog warm is.’

Andere onderzoeksgroepen zijn inmiddels bezig met pogingen om hele ribosomen – gigantische complexen van verschillende eiwitten – met de massaspectrometer te onderzoeken. Heck wil hetzelfde met virussen gaan doen. ’De meeste virussen bestaan maar uit een tiental eiwitten, maar de manier waarop die in de cel worden samengevoegd, daar is nog weinig over bekend. Met de massaspectrometer kan je onderzoeken welke eiwitten naast elkaar zitten en hoe een virus wordt opgebouwd. Voorheen hadden we alleen eiwitkristallografie en NMR.

’Die methoden geven wel veel meer gedetailleerde informatie. Maar het nadeel daarvan is dat je een paar milligram eiwit in handen moet hebben voor een meting. Bij massaspectrometrie kan je eindeloos zuiveren. Al heb je bij wijze van spreken na zuivering niets meer over, dan is het nog steeds voldoende om aan te meten.

Dit artikel is een publicatie van Bionieuws.
© Bionieuws, alle rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 08 april 2000

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.