Je leest:

Eiwitscheiding verklaart de rol van het cytoskelet in zaadkieming

Eiwitscheiding verklaart de rol van het cytoskelet in zaadkieming

Auteur: | 29 januari 2003

Biologisch onderzoek zit in een stroomversnelling door een technische revolutie in de moleculaire biologie. Proteomics, de studie naar de eiwitten in een organisme, draagt bij aan deze ontwikkeling.

Proteomics is een combinatie van oude technieken (zoals het scheiden van eiwitten op een gel) en nieuwe kennis (on-line database met genetische informatie). Door deze combinatie kan men in korte tijd veel te weten komen over de mogelijke functie van eiwitten en hun rol bij processen zoals zaadkieming.

Wat is proteomics?

Laten we beginnen bij het begin. Eiwitten zijn het product van genen. Zij worden na transcriptie van het DNA in mRNA gevormd door ribosomen. Deze organellen zijn de eiwitfabriekjes van de cel. Ribosomen binden aan mRNA. Deze moleculen zijn de boodschappers van genen die actief willen worden. Ze bezitten een code voor een volgorde van aminozuren, die uniek is voor elk eiwit. Het ribosoom zet de aminozuren in de juiste volgorde en poept ze als een lange sliert uit. Nadat het sliertvormige eiwit in de juiste vorm is gevouwen kan het zijn functie uitoefenen.

Het woord proteomics is afgeleid van proteoom, op dezelfde wijze als genomics is afgeleid van genoom. Het genoom is de totale verzameling van genen in een organisme. Genomics staat voor de studie van die verzameling. Het proteoom is het totale pakket van eiwitten van een bepaald organisme. Proteomics is dus de studie die hieraan is gewijd. Eiwitten worden al sinds jaar en dag bestudeerd. Maar het bijzondere van proteomics is dat het zoveel mogelijk eiwitten tegelijk poogt te bestuderen. En dat maakt proteomics tot een efficiënte technologie.

Afb. 1: Schematische voorstelling van een ééndimensionale eiwit electrophorese. Om monsters duidelijk te kunnen zien worden ze blauw gekleurd. Aan het eind van de electrophorese bevindt de blauwe kleurstof zich onder in de gel. De eiwitten zijn onzichtbaar, en moeten eerst worden gekleurd. klik op de afbeelding voor een grotere versie

Eiwitten scheiden met een gel

Iedere cel maakt een hele hoop verschillende eiwitten. Er is dan ook een nauwkeurige methode nodig om die eiwitten apart zichtbaar te maken. Een methode die al decennia bestaat, is electrophorese. Deze techniek bestaat uit het aanleggen van een elektrisch veld over een gel (Afb. 1). De gel die hiervoor wordt gebruikt is niet alleen redelijk stevig, maar bevat tevens kleine poriën. Wanneer eiwitmonsters worden aangebracht op de gel, dan lopen de eiwitmoleculen via de poriën de gel in. Gedreven door het spanningsverschil van het elektrische veld, verplaatsen kleine eiwitten zich snel, terwijl grotere eiwitten langzamer via het labyrint van poriën door de gel worden getrokken. Eiwitten worden zo op grootte (molecuulgewicht) gescheiden. Na specifieke kleuring zijn eiwitbanden zichtbaar. Deze techniek heet polyacrylamide gelelectrophorese (PAGE).

Afb. 2: Schematische voorstelling van tweedimensionale eiwit electrophorese. In de eerste dimensie worden de eiwitten gescheiden op lading (horizontaal), in de tweede dimensie op massa (verticaal).

Een tweede, vergelijkbare techniek heet isoëlektrisch focussen (IEF). Deze maakt onderscheid op lading in plaats van grootte. Elk eiwit is opgebouwd uit aminozuren, en aminozuren hebben een electrische lading. De lading van een geheel eiwit is de som van de ladingen van de afzonderlijke aminozuren waaruit het is opgebouwd. De gel die eiwitten scheidt op lading, heeft een pH gradiënt. Als hierop een elektrisch veld wordt aangelegd, lopen de eiwitten door de gel naar de pH-lokatie waar ze neutraal zijn.

Beide scheidingstechnieken zijn prima geschikt voor eiwitonderzoek, maar hebben één nadeel. Veel eiwitten komen op dezelfde plaats in de gel terecht, verscholen achter elkaar en zijn daardoor niet te onderscheiden. Niet elk eiwit komt in dezelfde hoeveelheid voor, en de ‘zeldzame’ eiwitten lopen meer risico om verscholen te blijven. Een truc die wordt toegepast om de resolutie te vergroten, is het gebruik van een tweedimensionale gel (Afb. 2). Op het platte vlak (de eerste dimensie) wordt een eiwitmonster gescheiden op lading. Vervolgens wordt de buisvormige gel een kwartslag gedraaid en op een vierkante gel aangebracht die de eiwitten scheidt op grootte (de tweede dimensie). Het is niet waarschijnlijk dat eiwitten die in de eerste dimensie geclusterd zijn, tevens een identieke grootte hebben. Het resultaat van een tweedimensionale gel is een vlekkenpatroon van eiwitten (Afb. 3), waarbij elke vlek een apart eiwit is.

Afb. 3 Voorbeeld van een tweedimensionale eiwitgel na kleuring.

Woordenboek

Het revolutionaire van deze techniek is de nauwkeurigheid van de scheiding, waardoor de massa en de lading van een eiwit nauwkeurig en reproduceerbaar zijn te bepalen. Om zeker te zijn van de identiteit van een eiwit kun je het uit de gel snijden en de sequentie (de aminozuurvolgorde) bepalen. Hierna volstaat het om het eiwit simpelweg op te zoeken in een database op het internet "":http://www.arabidopsis.org/ (http://www.arabidopsis.org/). Net alsof je er een woordenboek op naslaat!

Stel nu dat je geïnteresseerd bent in kieming van zaden. Je wilt weten of er eiwitten zijn die speciaal tot expressie komen wanneer zaden kiemen. Om dit te onderzoeken heb je twee eiwitmonsters nodig: één afkomstig uit zaden waarin het kiemingshormoon (gibberellinezuur) ontbreekt en die dus niet kunnen kiemen. En één van zaden die dit hormoon wel bevatten. Je scheidt vervolgens de twee monsters elk op een aparte gel en vergelijkt de twee vlekkenpatronen. Voor de meeste eiwitten blijkt er verrassend genoeg geen verschil te bestaan in genexpressie: er is evenveel van deze typen eiwit aanwezig in beide zaden (met of zonder hormoon). De expressie van de meeste eiwitten is dus niet afhankelijk van gibberellinezuur.

Er is echter één eiwit dat hiervan wel in grote mate afhankelijk is. Dat eiwit heet alpha-2,4-tubuline. Het maakt onderdeel uit van het cytoskelet, een driedimensionale draadvormige structuur die de cel zijn vorm geeft en die verantwoordelijk is voor de organisatie van celorganellen.

Wat kan je hieruit concluderen? Zonder kiemingshormoon (gibberellinezuur) ontstaat er geen cytoskelet component (alpha-2,4-tubuline) en verandert er niets aan de ongekiemde toestand van het zaad. De vorming en de functie van het cytoskelet zijn dus essentieel voor kieming. Na het toevoegen van gibberellinezuur is er voldoende tubuline aanwezig en vindt voltooiing van de kieming plaats. Door verder onderzoek te doen, kun je uitvinden of gibberellinezuur inderdaad de organisatie van celorganellen verandert.

Bronnen

Gallardo et al. 2002, Plant Physiology 129 pp.823-837

Voor vragen of opmerkingen n.a.v. dit artikel kunt u mailen met:

Dit artikel is een publicatie van Nederlands Instituut voor Biologie (NIBI).
© Nederlands Instituut voor Biologie (NIBI), sommige rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 29 januari 2003

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.