Vorig jaar ging de Nobelprijs voor Fysiologie en Medicijnen naar de ontdekkers van RNAi, een prestatie die grotendeels tot een enkele, recente publicatie is terug te voeren. Dit jaar valt de prijs in een heel andere categorie en gaat de eer naar de ontwikkelaars van een complete gereedschapskist met technieken, ontwikkeld in een kwart eeuw onderzoek.

Vijfentwintig jaar is lang, maar het aanbrengen van een plaatsgerichte mutatie (knock-out) in één van de 22 duizend genen in een muizencel is een ingewikkelde opgave. En dat geldt evenzeer voor het maken van een complete muis uit zo’n cellijn.

Mario Capecchi, Martin Evans en Oliver Smithies droegen hieraan bij met afzonderlijke technologieën. ‘Velen vinden het terecht dat er op deze manier aandacht wordt gegeven aan deze ontwikkeling’, zegt Anton Berns, directeur van het NKI in Amsterdam en degene die de eerste knock-outs in Nederland creëerde. ‘De juiste mensen worden hiermee geëerd’, zegt Berns, die de drie laureaten persoonlijk kent. ‘Martin Evans met zijn werk aan embryonale stamcellen, Capecchi en Smithies voor het onderzoek aan de mechanismen van homologe recombinatie.’

Martin Evans deed begin jaren zeventig als één van velen onderzoek aan embryonale kankercellijnen van muizen. Onder bepaalde omstandigheden zagen onderzoekers de embryonale kankercellijnen in kweek differentiëren tot allerlei soorten celtypen, van huid en bot tot kloppend hartweefsel. Na injectie van de cellijnen in muizenembryo’s ontstonden in 1975 chimere muizen, waarin weefsels deels van het embryo en deels van de cellijn afkomstig waren.

Embryonale stamcellen (ES-cellen) bleken niet alleen in tumoren voor te komen, maar ook in jonge muizenembryo’s. In het juiste kweekmedium met groeifactoren kunnen deze cellen lange tijd in ongedifferentieerde toestand worden gekweekt, rapporteerde Evans met collega’s in 1981 in Nature. In 1984 maakte hij met deze lijnen chimere muizen en weer drie jaar later toonde Evans dat de cellen genetisch gemodificeerd konden worden. Na injectie van de cellen in een embryo werden die soortvreemde genen aan het nageslacht doorgegeven.

Selectiestrategie

In zijn Nature-publicatie verwijst Evans naar het werk van Capecchi en Smithies, die in de jaren kort daarvoor publiceerden over het gericht modificeren van genen – gene targetting – in cellijnen.

Capecchi hield zich in de jaren tachtig bezig met het maken van transgene muizen. Zo ontwikkelde hij onder meer een methode om met een zeer dunne glaspipet genconstructen in de kern van een bevruchte muizeneicel te spuiten. Daarbij viel hem op dat als de genconstructen in het genoom terecht kwamen ze vaak kopstaart en in veelvoud werden ingebouwd. Capecchi realiseerde zich dat die structuren alleen konden ontstaan door het cellulaire mechanisme van homologe recombinatie.

Later zou hij van dit mechanisme gebruikmaken om het geïnjecteerde gen te laten recombineren met een vooraf gekozen plaats in het genoom. Oliver Smithies werkte in die tijd ook aan homologe recombinatie, het lukte hem in 1985 om een genconstruct exact te laten recombineren met het betaglobine-gen van een humane cellijn. Zowel Smithies als Capecchi hoorden van Evans’ successen met embryonale stamcellijnen en besloten met Evans’ hulp hun ervaring met homologe recombinatie op die stamcellen toe te passen.

Daarvoor moest nog wel een laatste horde worden overwonnen. Homologe recombinatie vindt namelijk plaats in gemiddeld één op de duizend cellen. Er moest dus een selectiestrategie worden gemaakt om die zeldzame recombinaties eruit te pikken. Door het genconstruct twee selectiemerkers mee te geven bleek dat mogelijk. Het construct heeft een neo-gen dat cellen resistent maakt voor neomycine plus een HSV-tk gen dat cellen gevoelig maakt voor de stof gancyclovir. Als het construct willekeurig integreert blijft het HSV-tk gen aanwezig, bij homologe recombinatie gaat het verloren. Daardoor kunnen vooral de cellen met een knock-out in aanwezigheid van neomycine en gancyclovir groeien – al is die methode niet helemaal waterdicht.

Capecchi publiceerde in 1988 de resultaten van die selectiestrategie op een embryonale stamcellijn. De gereedschapskist – celkweek, embryomanipulatie, genmanipulatie en selectietechnologie – was daarmee compleet. In 1989 publiceerden meerdere onderzoeksgroepen over hun eerste knock-out muizen.

Bij die frontrunners was ook de onderzoeksgroep van Berns, met een knock-out van een tumorsuppressorgen. ‘Zodra die technologie beschikbaar kwam zijn we er eind jaren tachtig mee begonnen. Voor de verfijning van de technologie waren we zelfs een beetje concurrent van Capecchi.’

Isogeen DNA

Berns’ groep ontdekte dat het gebruik van isogeen DNA de efficiëntie van de homologe recombinatie sterk beïnvloedt. Isogeen wil zeggen dat de DNA-sequenties in het recombinatieconstruct exact overeenkomen met het DNA van de ES-cellen.

Berns: ‘Muizenlijnen kunnen genetisch behoorlijk variëren. Als er kleine verschillen bestaan tussen het genconstruct en de plaats in het genoom waar recombinatie moet optreden, dan kan mismatch repair de targetting ongedaan maken. Het effect kan heel groot zijn. Gebruik van isogeen DNA draagt dus bij aan de efficiëntie van gene targetting.’

Volgens Berns is de waarde van knock-out muizen nauwelijks te overschatten. ‘Voordat er knock-outs mogelijk waren, hadden we geen idee of een gen essentieel was of niet. Neem bijvoorbeeld p53. Uit onderzoek in weefselkweek werd afgeleid dat het absoluut essentieel moest zijn, maar de knock-out bleek zonder veel problemen te functioneren. In een compleet organisme kun je kortom het gen in al zijn interacties onderzoeken. Of in de ontwikkeling van een organisme.’

Buiten fundamentele inzichten in de biologie zijn er ook zeer praktische toepassingen. Berns: ‘Het overdrachtmechanisme van BSE is door onderzoek aan knock-out muizen van een sluitend bewijs voorzien. Door het PRNP-gen in muizen uit te schakelen, bleek er geen overdracht van de ziekte meer plaats te vinden. Een gen dat normaal in de hersenen voorkomt bleek daarmee essentieel voor het verspreiden van prionziekten. Bovendien kon zo worden bepaald wat de soortgrenzen zijn bij overdracht van de ziekte.’

Ziektemodellen

‘De grootste impact komt door de mogelijkheid relaties te leggen met menselijk ziekten’, zegt prof. Sjaak Philipsen, moleculair bioloog aan het Erasmus MC. Hij werkt in de afdeling van prof. Frank Grosveld, samen met prof. Jan Hoeijmakers een van de andere pioniers op het gebied van knock-outs in Nederland. Philipsen: ‘We hebben hier modellen voor verouderingsziekten of neurologische ziekten als het fragiele X-syndroom. Daarmee worden nieuwe therapieën ontwikkeld. Dat geldt bijvoorbeeld ook voor knock-out modellen van taaislijmziekte, die zijn jaren geleden gemaakt en worden nog steeds gebruikt. Het muismodel van taaislijmziekte dat in Rotterdam is gemaakt door dr. Bob Scholte is een knock-out waarbij één aminozuur uit het CF-eiwit is verwijderd. Deze mutatie is de meest voorkomende oorzaak van taaislijmziekte. Het onderzoek stopt kortom niet bij het maken en beschrijven van de knock-out, de waarde voor het preklinisch onderzoek is minstens even groot.’

‘De basisprincipes voor het maken van knock-outs zijn hetzelfde gebleven’, zegt Berns. ‘Wat tegenwoordig wel veel meer gebeurt is het maken van conditionele of induceerbare knock-outs. Daarbij wordt het gen uitgeschakeld in een weefsel, of in een bepaald ontwikkelingsstadium.’

Volgens Philipsen heeft de bioinformatica ook veel veranderd; van de muis is het genoom tot op de letter bekend. ‘Je kunt nu achter de computer je genconstruct ontwerpen en in elkaar zetten. Vroeger moest je het gen eerst eigenhandig kloneren en in kaart brengen. Die stap gaat kortom veel sneller dan voorheen. Wat ook steeds meer mogelijk wordt, is het doorzoeken van internationale ES-celbanken met knock-outs. Als we een interessant gen op het oog hebben, kijken we eerst in de database of er een ES-cel knock-out aanwezig is. Zo’n cellijn in huis halen kan heel veel tijd schelen.’

De Amerikaanse NIH heeft in 2005 het startsein gegeven voor het aanleggen van zo’n knock-out resource. Doel is het genereren en samenbrengen van ES-cel knock-outs van alle 22 duizend genen in het muizengenoom. Onderzoekers kunnen hieruit cellijnen opvragen en daarmee een knock-out muis maken. Dit zogenaamde Knockout Mouse Project is niet het enige grootschalige knock-out project. Ook The International Gene Trap Consortium streeft naar het uitschakelen van alle muizengenen, zij het niet via homologe recombinatie.

Berns ziet voor de toekomst ruimte voor tijdwinst in het genereren van knock-outs met combinaties van mutaties. ‘Soms wil je vier bestaande knock-outs combineren in één muis. Dat vraagt een tijdrovend en kostbaar fokprogramma. Zodra je die vier mutaties eerst in een ES-cellijn kunt aanbrengen, scheelt dat veel tijd. Die moleculaire oplossing is overigens nog steeds een ingewikkelde operatie, maar we bekijken of het een kant is die we op moeten gaan.’

Literatuur:

Hansson, G.K. (2007) Gene modification in mice. Karolinska Institutet, nobelprize.org Collins, F.S. et al. (2007) A Mouse fo all reasons. Cell 128: 9-13

Zie ook:

• Knockout Mouse Project
• The International Gene Trap Consortium
• Knock-in en knock-out – Revolutie in muizengenetica (artikel van Watisgenomics)
• Knock-out muizen (artikel van Watisgenomics)