Sinds halverwege de jaren negentig de eerste artikelen verschenen over het gebruik van zogenaamde DNA chips in verschillend celbiologisch en later ook klinisch onderzoek is er een ware hausse rondom deze nieuwe technieken ontstaan. Het monitoren van het ‘transcriptome’ werd hot, en je hoorde er niet meer bij als je het niet deed. Later kwamen daar nog het ‘proteome’, metabolome’ en het ‘localosome’ bij zodat je kan spreken over een ware ‘-ome’ revolutie in het moderne celbiologische onderzoek. In dit stuk zal getracht worden wat licht te schijnen over deze nieuwe technieken die nog steeds constant verbeterd en uitgebreid worden.

De basis

Even terug naar de basis. Het menselijke lichaam is opgebouwd uit miljarden cellen. In elke cel zit ons erfelijke materiaal opgeslagen: het DNA. Het DNA is als het ware de blauwdruk van ons lichaam inclusief een groot deel van je karakter en andere persoonlijke eigenschappen. Dit DNA zit in de cel eigenlijk een beetje te niksen tot het afgelezen wordt omdat er een bepaald stuk informatie, een gen, nodig is. Tijdens het aflezen wordt er een kopie gemaakt in de vorm van messenger RNA (mRNA). Dit mRNA wordt daarna vertaald in het eiwit dat uiteindelijk de klus gaat klaren. Om even een voorbeeld te geven. Stel je drinkt een glas alcohol. Deze alcohol moet worden afgebroken door de cellen van je lichaam. De cel maakt daarom een mRNA kopie van het DNA dat codeert voor het enzym alcohol-dehydrogenase. Dit mRNA wordt daarna vertaald in het enzym dat vervolgens zijn functie kan vervullen en de alcohol af gaan breken.

DNA bestaat uit twee strengen die ieder opgebouwd zijn uit aaneengeregen moleculen, de basen, waarvan er vier verschillende bestaan. Zoals computers hun informatie binair opslaan in éénen en nullen doet het DNA dat dus in vieren namelijk in A-tjes, G-tjes, C-tjes en T-tjes waarbij elke letter een andere base voorstelt. Belangrijk om te weten is dat de twee strengen elkaars spiegelbeeld zijn: tegenover een A zit altijd een T en tegenover een C altijd een G en andersom. Met andere woorden; de ene DNA-streng is complementair aan de andere. Bij het aflezen van het DNA wordt mRNA gemaakt. Dit mRNA is in tegenstelling tot het DNA meestal enkelstrengs en bestaat uit dezelfde 4 letters alleen is de T vervangen voor een U. Als je de lettervolgorde weet van het mRNA kan je zelf een complementaire streng maken: een probe. Deze probe kun je dan laten binden (hybridiseren) met het mRNA van een specifiek gen (zie afbeelding 1). Aan deze probe kan je een radioactief of fluorescent label bevestigen waardoor die goed te detecteren is. Op deze manier kan je dus makkelijk de aanwezigheid van specifieke mRNA strengen detecteren. Het op deze manier meten van de expressie van één enkel gen is al jaren bekend als de zogenaamde northern blot methode. Een voorwaarde voor deze techniek is dat de sequentie (volgorde van de basen) oftewel de identiteit van de verschillende genen bekend is. Dat was tot voor kort niet altijd het geval maar in de laatste jaren zijn echter steeds meer sequenties van complete genomen bekend geworden, zelfs het humane genoom is recentelijk opgehelderd. Dit maakt de weg vrij om van alle humane genen de transcriptie te meten. Als dit met behulp van de conventionele technieken, zoals de northern blot methode, gedaan zou moeten worden dan zou dit behoorlijk lang duren. Er zijn tegenwoordig echter DNA chips die het mogelijk maken om van alle genen tegelijk de expressie, oftewel de activiteit, te meten.

DNA-chips

Het humane genoom, het totale DNA, bestaat uit ongeveer 30.000 genen waarvan de producten samen zeer uitgebreide en ingewikkelde netwerken vormen. Eerder genoemd voorbeeld van het glas alcohol en de reactie daarop is een nogal versimpelde versie van de werkelijkheid omdat daar veel meer genen bij betrokken zijn. Het kan daarom erg waardevol zijn om van alle genen tegelijk te meten wat ze aan het doen zijn. Dit is mogelijk met behulp van een DNA chip. Een DNA chip bestaat uit een drager, meestal een glasplaatje of een nitrocellulose filter, waarop een raster is bevestigd met probes van verschillende samenstelling. Ieder rasterpunt bestaat dus uit een heleboel identieke probes die kunnen hybridiseren met mRNA van één specifiek gen. Er zitten een heleboel rasterpunten op één DNA chip, dus passen er een heleboel probes op één DNA chip. De precieze hoeveelheid verschilt nogal per chip, maar het bedrijf Affymetrix levert bijvoorbeeld een chip met 8500 humane genen. Daarmee kun je dus in één klap de activiteit van 8500 genen tegelijk meten. Hoe krijg je nu echter informatie over de activiteit van alle verschillende genen?

Stel, je bent geïnteresseerd in kanker en je wilt weten welke genen er in een kankercel actief zijn in vergelijking met een normale cel. Je isoleert mRNA van de kanker- en de normale cel. Het kanker mRNA geef je een groen fluorescent label en het gewone mRNA geef je een rood fluorescent label. Dit verschilt dus met de oude northern blot methode want daarbij werd aan de probe een label gehangen in plaats van aan het mRNA. Het gelabelde mRNA laat je nu hybridiseren met de DNA chip. Het mRNA zal alleen hybridiseren daar waar het zijn complementaire probes tegenkomt (zie afbeelding 2). Dit resulteert in een bonte kleurenmix waarbij sommige rasterpunten rood fluoresceren, andere zullen groen fluorescent zijn en er zullen ook gele fluorescente punten ontstaan. Omdat je weet op welke rasterpunten welke specifieke probes zitten, weet je dat een rood rasterpunt betekent dat het corresponderende gen alleen tot expressie komt in een normale cel. Een groen rasterpunt betekent dat dat gen alleen in de kankercel tot expressie komt terwijl een geel punt betekent dat dat punt zowel rood als groen fluoresceert en dat het respectievelijke gen dus zowel in de kanker als in de normale cel tot expressie komt (zie afbeelding 3). Deze techniek wordt al toegepast in de geneeskunde om de juiste diagnose te kunnen stellen, bijvoorbeeld om te kunnen zien in welk stadium een zich ontwikkelende kanker zich bevindt.

Met behulp van deze DNA chips is het dus mogelijk om een soort totaaloverzicht te krijgen van allerlei processen die zich tegelijkertijd afspelen in de cel. Je bent er nog niet natuurlijk, want nu begint het analyseren van al die gegevens pas. Door de hoeveelheid gegenereerde data is dit niet zo makkelijk. Computers zijn hierbij dan ook onontbeerlijk. Behalve een behoorlijke biologische achtergrond is dus een zekere affiniteit met mathematische benaderingen van grote databases bijzonder handig in dit onderzoek.

Computer chips en DNA-chips

Zoals reeds benadrukt zijn computers en computervaardigheid essentieel in dit soort onderzoek. Je hebt ze nodig bij het inlezen van het signaal zelf, maar ook bij het analyseren van de grote datasets. In een bekend onderzoek van de universiteit van Stanford is met behulp van de computer gezocht in 80 datasets die ieder 6000 genen bevatten naar periodiek geactiveerde genen. De biologische samples die hieraan ten grondslag lagen kwamen in dit geval van gisten die gelijktijdig delen. Uiteindelijk wist de groep door het kiezen en ontwerpen van de juiste algoritmen 800 genen te identificeren die een periodiciteit demonstreerden die overeenkwam met de cel cyclus tijden (voor een grafische representatie hiervan zie figuur 4).

Proteome

Data omtrent expressieniveaus van mRNA is dus niet zo moeilijk meer om aan te komen. Echter de daadwerkelijke uitvoerders van de ‘klussen in de cel’ zijn niet de mRNA’s maar de eiwitten. De hoeveelheid mRNA hoeft echter lang niet altijd te kloppen met de aanwezigheid van het corresponderende eiwit. Daarom begint het accent langzaam een beetje te verschuiven van genomics naar proteomics. Het proteome zijn de expressieniveaus van alle eiwitten bij elkaar. Data hieromtrent zijn op verschillende manieren te verkrijgen. Allereerst is het mogelijk om met behulp van 2D-electroforese de eiwitten te scheiden op grond van twee parameters, namelijk lading en grootte, die samen een behoorlijk unieke positie opleveren op een acrylamide gel. Dit is een gelatine-achtige plaat waarin de eiwitmengsels worden gespoten. Met behulp van electriciteit worden de eiwitten op grootte en lading van elkaar gescheiden en verdeeld over de plaat. Vergelijk de gelen (meervoud van gel) met samples van verschillende condities met elkaar, en zoek de verschillen. De verschillen kunnen dan met behulp van massaspectroscopie geïdentificeerd worden. Bij deze techniek worden de eiwitten kapot geschoten en heel nauwkeurig het gewicht van de brokstukken bepaald. Hieruit kan men aflezen wat de identiteit van het originele eiwit was.

Een nieuwere techniek lijkt echter een beetje op de eerder besproken DNA chip maar dan dus voor eiwitten, genaamd de antilichamen chip. Deze techniek staat nog in zijn kinderschoenen maar zal ongetwijfeld binnenkort meer resultaten opleveren. In dit geval zitten er in plaats van probes, specifieke antilichamen op een drager. Deze antilichamen kunnen eiwitten in een sample herkennen. Als je nu twee biologische samples hebt die je met elkaar wilt vergelijken dan label je de ene weer rood en de ander groen fluorescent. Na het inlezen van de antilichamen chip kom je dus te weten welke eiwitten wel in het ene sample aanwezig waren maar niet in het andere en andersom.

Nog meer –ome’s

Naast het reeds besproken transcriptome en proteome zie je her en der andere termen met het achtervoegsel ‘ome’ opduiken. Zo is daar bijvoorbeeld het localosome. Het aanwezig zijn van een eiwit in een biologisch sample hoeft namelijk nog niet te betekenen dat het eiwit ook daadwerkelijk actief is. Een factor hierbij van groot belang is namelijk waar het eiwit zich op dat moment in de cel bevindt. Een receptor die op het oppervlak van de cel zit doet namelijk heel iets anders dan een receptor die binnenin de cel zit en zo zijn er nog tal van mogelijkheden op te noemen. Sommige wetenschappers hebben daarom de term ‘localizome’ bedacht om aan te geven dat een genoom-brede aanpak van de lokalisatie van eiwitten ook belangrijk is. De eerste stappen zijn ook al in die richting gedaan met de constructie van een bank met 6000 giststammen waarin elk gen is voorzien van een fluorescent label. Bij het bekijken van die 6000 stammen onder de microscoop is de locatie bepaald van het fluorescente label. Een probleem bij dit soort technieken is dat niet altijd zeker is of het label de lokalisatie niet beïnvloedt. Bovendien is de nauwkeurigheid van de opnamen bij dit onderzoek bijzonder matig en is de toegekende locatie dus vaak twijfelachtig.

Het ‘metabolome’ is een term van toepassing op concentraties van allerlei metabole stofjes die zich in de verschillende cellen ophouden. Denk hierbij aan glucose, ATP, NADH, losse aminozuren, losse nucleïnezuren etc. Met behulp van chromatografie, massaspectroscopie, NMR en andere technieken probeert men ook hierin inzicht te verkrijgen. Wederom kan er nog zoveel van een eiwit aanwezig zijn, als de benodigde cofactor niet aanwezig is (bijvoorbeeld NADH) dan doet het eiwit niet veel. Ook concentraties van kleine metabole stoffen zijn dus belangrijk te weten. Dan hebben we nog het ‘protein interactome’, waarbij alle interacties die eiwitten met elkaar kunnen aangaan in één keer gemeten worden met behulp van massaspectroscopie. Dan is er nog een specifieker onderzoek namelijk het ‘glycosome’ waarbij specifiek gekeken wordt naar interacties tussen eiwitten en suikerresiduen. Zoals je leest zijn er een heleboel ‘-omes’, en zijn er vast nog een paar die ik vergeten ben.

Conclusie

Nieuwe technieken die de laatste 10 jaar ontwikkeld zijn brengen het hele celbiologische onderzoek in een stroomversnelling. Het in één keer monitoren van alle veranderingen die een bepaalde behandeling of fysiologische omstandigheid met zich meebrengt op mRNA niveau wordt al bijna door ieder lab toegepast. De statistische bewerkingen die op de datasets worden toegepast zijn nog niet in de routine-fase en de interpretatie van de resultaten is ook niet altijd even makkelijk. Zonder de juiste benadering blijft het soms zoeken naar een naald in een hooiberg. Daarbij komt dat alhoewel het totale humane genoom opgehelderd is, van lang niet alle eiwitten bekend is wat voor functie ze hebben. Deze nadelen kleven ook aan de andere ‘-omes’ zoals het proteome, metabolome etc., terwijl bij deze methoden ook nog eens technische moeilijkheden de zaak vertragen. Bovendien zijn er nog geen goede standaard methoden ontwikkeld om dit soort large-scale resultaten te presenteren aan de rest van de wetenschappelijke gemeenschap, alhoewel er al wel initiatieven in die richting zijn gestart. Dit soort problemen zullen echter van tijdelijke aard zijn. Uiteindelijk zullen ze opgelost worden en zal juist de combinatie van deze verschillende technieken tot een beter begrip van de cel leiden.

Bronnen

Subcellular localization of the yeast proteome, Kumar A. et al., Genes Dev 2002 Mar 15;16(6):707-19

A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome, Ito T. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 10;98(8):4569-74.

Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization, Spellman PT. et al.,Mol Biol Cell. 1998 Dec;9(12):3273-97.