Je leest:

Méér dan een moleculaire trukendoos

Méér dan een moleculaire trukendoos

De patholoog in het ziekenhuis is gewend om via de microscoop naar de vorm van cellen en weefsels te kijken. De biochemisch onderzoeker bekijkt ‘in de reageerbuis’ de moleculaire reacties die de grondslag vormen van ziekte en gezondheid. In de cytochemie en cytometrie ontmoeten deze twee benaderingen elkaar: moleculen worden in beeld gebracht in de context van de cel. Dat bleek uit de oratie van prof. dr. A.K. Raap (‘Cellen en moleculen microscopisch in beeld’).

“Van huis uit ben ik biochemicus. Toen ik hier kwam werken, keek ik voor het eerst door een microscoop – en ik was meteen verkocht. Niet alleen heeft een microscoopbeeld een eigen schoonheid, maar je kunt er ook heel veel informatie uit halen. Het spreekt meer tot de verbeelding dan een streepjespatroon op een gel. Dat geldt zeker ook voor pathologen en cytogenetici”, vertelt Raap in een gesprek naar aanleiding van zijn oratie.

De gedachte dat cellen ten grondslag liggen aan vrijwel alle levensprocessen en dus ook aan het ontstaan van ziekte, ontstond in de 19de eeuw. Deze ontdekking werd mogelijk door verbetering van de microscoop en toepassing van kleurstoffen die ook in de toenmalige textielindustrie werden gebruikt.

Subtielere veranderingen zichtbaar maken

Veel ziekten worden gekenmerkt door veranderingen van de vorm (morfologie) van cellen. Tot op de dag van vandaag stelt de patholoog diagnoses op grond van het microscopisch beeld van aangekleurde cellen en weefsels. Naarmate de kennis over de biochemische reacties in de cel toenam, groeide de behoefte om ook subtielere veranderingen zichtbaar te maken. Een gewone kleuring berust op een vrij grofstoffelijke binding van kleurstoffen aan celonderdelen. Zo zijn er kleurstoffen die vooral binden aan de celkern, terwijl andere kleurstoffen de celvloeistof om de kern aankleuren. Een afwijkend eiwit of een afwijkend gen zijn in een gewoon microscooppreparaat niet te zien.

Sinds de tweede helft van de 20ste eeuw kunnen (afwijkende) eiwitten in de cel ook gericht worden gekleurd. De techniek berust op het feit dat antilichamen specifiek een stukje van een eiwit ‘herkennen’. Door aan een antilichaam een fluorescerende kleurstof te koppelen, kan gericht worden gekeken naar de aan- of afwezigheid van eiwitten in en rond cellen. Deze zogeheten immunocytochemische techniek wordt dan ook veel toegepast in het basale en diagnostisch onderzoek.

Lichtgevende genen

Om de werking van de (zieke) cel te begrijpen, moeten echter naast specifieke eiwitten ook de voor de eiwitten coderende genen en hun boodschappers (DNA en RNA) in cellen in beeld gebracht worden. Dit werd in het begin van de jaren tachtig mogelijk door gebruik te maken van de principes van de moleculaire biologie. Elk DNA-molecuul bestaat uit een dubbele streng, waarbij de volgorde van de bouwstenen met elkaar overeenkomt. Als men de bouwstenen (basen) door letters weergeeft, ligt tegenover elke A een T en tegenover elke C een G. Het fragment AATGGC op een van de DNA-strengen betekent dat op de tegenovergelegen streng TTACCG te lezen is.

Als men de dubbele streng met biochemische middelen uiteen laat gaan en een ‘los’ stukje DNA aan de cel toevoegt, zal er binding optreden als de volgorde van de DNA-‘letters’ exact overeenkomt. Dit ‘soort zoekt soort-mechanisme’, zoals Raap het in zijn oratie noemde, bleek niet alleen in de reageerbuis te werken, maar ook bij intacte cellen. Door aan het ‘losse’ toegevoegde DNA-fragment een fluorescerende kleurstof te koppelen, kon men in de celkern gericht genen aantonen. De succesvolle ontwikkeling en brede toepassing van FISH (fluorescentie in situ hybridisatie) in celbiologie en genetica is mede door Raap’s onderzoek tot stand gekomen.

De woorden ‘in situ’ betekenen ‘op de plaats’ om het verschil aan te geven met de ‘gewone’ hybridisatie in een reageerbuis of op een gel. Want dat is het doel van Raap en zijn collega’s: “De cel moet als het ware zijn eigen reageerbuis en meetcuvet zijn”. In combinatie met de zeer gevoelige methoden om eiwitten op te sporen via antilichamen kan zo een zeer verfijnd beeld ontstaan van ‘het hele traject van DNA naar RNA naar eiwit’. “Het is alsof je met een heel fijn penseel een moleculair-biologisch plaatje van de cel schildert”, aldus de nieuwe hoogleraar in zijn oratie.

Grotere precisie met fiber-FISH

“Het DNA in een cel weegt slechts 6 picogram, dat is zesmiljoenste van een miljoenste gram. Deze geringe gewichtshoeveelheid is niettemin goed voor twee genetische boeken met elk 3 miljard letters uit het vierletterige genetische alfabet, en naar laatste schatting zo’n 100.000 tot 140.000 verschillende genen”, vertelde Raap in zijn oratie. Met de hierboven beschreven FISH-techniek kon men ‘met gepaste trots vertellen dat een stukje DNA binnen een chromosoomsegment van 3 miljoen genetische letters of baseparen lag, maar ook niet meer dan dat’. Om aan te sluiten bij het genoomonderzoek was zo’n duizendmaal grotere precisie nodig: “Het was zaak om met zo min mogelijk verlies van overzicht het oplossend vermogen met minimaal drie ordes van grootte te verbeteren. Vergelijk het met het inzoomen van de kaart van Europa naar de stadskaart van Leiden”.

Het DNA ligt strak opgerold in chromosomen in de celkern. Een stukje fluorescerend DNA dat in die celkern met het overeenkomstige DNA-fragment wil hybridiseren is te vergelijken met iemand die zijn geliefde zoekt in een dicht opeengepakte mensenmassa in een gigantisch stadion vol met door hekken afgebakende vakken. Het lokaliseren van een gen op een chromosoomsegment, wat overeenkomt met het snel “spotten” van de geliefde in een vak van het stadion is dus inderdaad al een prestatie. “Het is eigenlijk een wonder dat we met FISH iets zien”, zegt Raap in het gesprek.

Om toch met meer precisie te kunnen FISH’en moet het DNA uit zijn verpakking worden gehaald. Door de cel biochemisch te behandelen kan men het DNA ontrollen, zodat het als zeer lange draden op het microscoopglaasje zichtbaar wordt. Op dit ‘naakte’ DNA blijkt de FISH-techniek inderdaad veel preciezer te zijn: genfragmenten van enkele honderden baseparen kunnen worden aangetoond. Deze techniek, die fiber-FISH genoemd wordt, leent zich heel goed voor het in kaart brengen van genen en vindt onder meer toepassing in het wereldwijde Human Genome Project.

Kleurenbarcodes van ziektegenen

Fiber-FISH is niet alleen nuttig gebleken voor het in kaart brengen van genen, het kan ook gebruikt worden bij de diagnostiek van ziekten. Als men bij een gen verschillende fragmenten van verschillende kleurstoffen voorziet, ontstaat in het fiber-FISH beeld een karakteristiek patroon van afwisselend gekleurde stukken DNA. Zoals Raap het in zijn oratie uitdrukte, kunnen er ‘kleurenbarcodes’ worden gemaakt. “Verstoringen in de barcode op DNA-draden van patiëntencellen geven dan aan of er structureel iets fout is in het gen”, aldus Raap, “Bij een aantal patiënten werden deleties (het ontbreken van delen van een gen) in het grote gen dat verantwoordelijk is voor de spierdystrofie van Duchenne rap in kaart gebracht”. De techniek bleek ook geschikt bij het onderzoek naar een bepaald type bloedcelkanker, het zogeheten mantelcellymfoom. Kenmerkend voor deze ziekte is een translocatie: een gedeelte van chromosoom 11 breekt af en belandt op chromosoom 14. Zo’n translocatie kan ertoe leiden dat genen die een rol spelen bij de celdeling geactiveerd of beschadigd worden, en zo een eerste stap zijn op weg naar kwaadaardige verandering. Als men zo’n translocatie zichtbaar kan maken, levert dat een belangrijke bijdrage aan de diagnostiek.

Het probleem bleek echter dat het chromosoom op een groot aantal plaatsen kon breken. Met de gebruikelijke technieken is het onbegonnen werk om dit aan te tonen. Met de ‘kleurenbarcodes’ van de fiber-FISH slaagden de onderzoekers bij Pathologie onder leiding van prof. dr. Ph. Kluin en de onderzoeksgroep van Raap bij Moleculaire Celbiologie hier wel in. Raap heeft de smaak te pakken en verwacht dat door nieuwe technieken ook chromosomale afwijkingen bij andere vormen van kanker beter in kaart gebracht kunnen worden.

Chromosomen tellen met COBRA

De naoorlogse kunstenaarsgroep COBRA stond bekend om haar uitbundige kleurgebruik. Het palet van de fluorescerende kleurstoffen dat bij FISH wordt toegepast was tot voor kort nog maar zeer beperkt. Jarenlang moest men met hooguit drie kleuren werken. Beperking dwingt tot creativiteit, en op een goede dag kwamen de Leidse onderzoekers op het idee de kleurstoffen in verschillende verhoudingen te mengen. De nieuwe techniek werd COBRA genoemd (COmbined Binary RAtio labeling). Zo groeide het aantal mogelijke kleuren snel en kan men nu al routinematig met 48 ‘FISH’-kleuren werken.

Dit levert niet alleen kunstzinnige plaatjes op, maar maakt het ook mogelijk om in de celkern elk chromosoom een andere kleur te geven. Tellingen van chromosomen en genen zijn belangrijk bij prenatale diagnostiek. Zo kan men in niet-delende cellen aantonen dat chromosoom 21 in drievoud aanwezig is en er dus sprake is van het syndroom van Down. Voor het kankeronderzoek schept de genentelling in de celkern extra mogelijkheden, omdat bij kankercellen vaak genen verdwenen of juist in meervoud aanwezig zijn.

Toepassing belangrijk

Raap bespreekt in zijn oratie nog een groot aantal andere onderzoeken, zoals de nieuwe DNA-chiptechnologie, de analyse van levende cellen met behulp van fluorescerende eiwitten en onderzoek aan het transport van RNA-moleculen vanuit de celkern naar de celvloeistof. Nieuwe ontwikkelingen op het gebied van de microscopie hebben direct invloed op de ontwikkeling van zijn vakgebied.

Toch wil hij benadrukken dat zijn vak meer is dan een moleculaire trukendoos. Juist de toepassing in de patiëntgerichte praktijk maakt het volgens hem interessant: "Het is mijn vaste overtuiging dat juist op het grensvlak van toepassing en methodiekontwikkeling de vernieuwing tot stand komt. Het begrip van iets kan namelijk niet beter zijn dan de gereedschappen waarmee het bestudeerd wordt. Alleen door toepassing van de onderzoekgereedschappen leer je de grenzen kennen en zul je naar fundamenteel nieuwe middelen gaan zoeken om ze te doorbreken’’, zei hij in zijn oratie. En daarmee bevestigt hij een positief cliché over technisch aangelegde mensen: ze bouwen goede bruggen.

Dit artikel is een publicatie van Cicero (LUMC).
© Cicero (LUMC), alle rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 10 maart 2000

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.