Door puur toeval ontdekte Alexander Fleming in 1928 een bacteriedodende schimmel tijdens zijn werk aan bacteriecultures. Zich zeer bewust van de mogelijkheden van bacteriedodende stoffen, experimenteerde Fleming enige jaren met extracten van de schimmel. Uiteindelijk leidde zijn werk, samen met dat van anderen, tot de isolatie van het meest bekende antibioticum ter wereld: penicilline.

Minder bekend is dat de antibiotische activiteit van de producerende schimmel al in 1875 werd beschreven door J. Tyndall en in 1925 nogmaals door D. Gratia. Het is aannemelijk dat er meer van dergelijke waarnemingen zijn geweest, die evenals de bovenstaande twee, niet tot een concreet medicijn hebben geleid. Ook na de ontdekking van de penicillineproducent Penicillium notatum, moest er nog een hoop werk verzet worden. In een enkele maanden durende chemische tour de force hebben de vasthoudende Howard Florey en Ernst Chain het actieve bestanddeel in bruikbare hoeveelheden uit schimmelextracten opgezuiverd. Hun succes leidde tot de produktie, door farmaceutische bedrijven, van voldoende penicilline voor gebruik in de latere jaren van de Tweede Wereldoorlog. Een Nobelprijs voor de drie heren was later dan ook niet meer dan logisch.

Overvloed van antibiotica in de bodem

Nog zeer vele antibiotica zijn naderhand ontdekt bij het screenen van grote hoeveelheden bacteriën en schimmels. Er zijn voorbeelden te over, maar één van de eerste was toch wel streptomycine door Waksman, geïsoleerd uit Streptomyces griseus. Dit type bodembacterie bleek een vrijwel onuitputtelijke bron van nieuwe typen antibiotica; bijvoorbeeld tylosine uit S. fradiae, rifampicine uit S. mediterraneus, erythromycine uit S. erythraeus en hygromycine uit S. hygroscopicus.

Deze antibiotica bleken niet allen even bruikbaar in de geneeskunde, maar vonden hun plek in de moleculaire gereedschapskist van vele laboratoria. Antibiotica betekend namelijk letterlijk ‘tegen leven’. Sommige antibiotica zijn dan ook zeer giftig voor vele typen organismen. Meestal wordt met de term antibioticum, tenzij anders vermeld, een anti-bacterieel antibioticum bedoeld. Antibiotica tegen schimmels worden meestal antimycotica genoemd.

Werkingsmechanisme antibiotica

Antibiotica die gebruikt worden als medicijn, delen meestal de eigenschap dat ze zeer giftig zijn voor de te bestrijden bacteriën of schimmels en niet of slechts mild toxisch zijn voor de mens. Dit heeft te maken met hun werkingsmechanisme. Penicilline remt bijvoorbeeld een stap in de opbouw van de bacteriële celwand. De celwand is de behuizing van de bacterie dus het spreekt voor zich dat een bacterie met een celwand die half af is niet kan leven. Omdat menselijke cellen geen celwanden bevatten, zijn mensen in principe niet gevoelig voor penicilline.

Het antibioticum streptomycine echter remt een stap in de eiwitsynthese die plaatsvindt in de ribosomen. Nu bevatten menselijke cellen ook ribosomen in het cytoplasma, toch worden deze niet geremd door streptomycine. Dit komt omdat eukaryoten (organismen die een echte celkern hebben), waartoe ook de mensen behoren, andere type ribosomen bevatten dan de prokaryote bacteriën. De bacteriën bevatten ribosomen van het 70S type, terwijl menselijke cellen ribosomen van het 80S type bevatten. Nu is er een maar aan dit verhaal. Mitochondriën in menselijke cellen stammen af van bepaalde bacteriën. Althans, dat denken veel wetenschappers die de endosymbiont theorie aanhangen. Ze bevatten daarom ook streptomycine gevoelige ribosomen van het 70S type. Een te hoge dosis streptomycine is dus uiteindelijk ook voor de mens fataal.

Antibiotica remmen dus noodzakelijke levensprocessen bij bacteriën. Deze processen zijn of niet aanwezig in de mens of ze zijn bij bacteriën anders. Eukaryote antibiotica remmen dus selectief eukaryote levensprocessen. Een voorbeeld is alfa-amanitine, een cyclisch peptide (klein eiwit) uit de schimmel Amanita phalloides, waarvan de paddestoel bekend staat als de uiterst giftige groene knolamaniet. Dit eukaryote antibioticum ontregelt de vertaling van DNA naar RNA. Meer nauwkeurig: het remt de werking van RNA polymerase II, verantwoordelijk voor de produktie van mRNA, al in zeer lage concentraties. Het mitochondriale RNA polymerase is net als het bacteriële ongevoelig voor amanitine, maar wel voor het anti-bacteriële antibioticum rifampicine. Zo kan de combinatie rifampicine en amanitine gebruikt worden om te laten zien welk organel (de kern of het mitochondrium) een bepaald eiwit (RNA) maakt. Rifampicine is verder bruikbaar als geneesmiddel tegen bacteriële infecties. Amanitine kan alleen in laboratoria gebruikt worden.

Er bestaan ook antibiotica die processen van zowel bacteriën als eukaryoten ontregelen. De eiwitsyntheseremmer puromycine is daarvan een goed voorbeeld. Het gebruik van puromycine is daarom vrijwel beperkt tot onderzoek naar eiwitsynthese.

Structuur penicilline

De reden dat Fleming er niet in slaagde penicilline te isoleren hangt nauw samen met het werkingsmechanisme van het antibioticum. Penicilline is namelijk zeer reactief door de beta-lactamring; een ring van vier atomen, waarbij een enorme ‘spanning’ op de verbindingen tussen de atomen staat. Dit resulteert in een hoge reactiviteit van de ‘peptide’ binding tussen C=O en N.

De eerste aanwijzingen voor het werkingsmechanisme van penicilline kwamen van een serie proeven gedaan door J. Lederberg. Zoals bovengenoemd verstoort penicilline de opbouw van de bacteriële celwand. Hij toonde dit aan doordat bacteriën blootstelling aan penicilline wel kunnen overleven als ze maar in een isotoon medium groeien. Een isotoon medium heeft dezelfde osmotische waarde als het bacteriële cytoplasma.

Een bacterie zonder celwand heeft alleen zijn celmembraan nog als barrière naar de buitenwereld. Hij zag dat de bacterie in het isotone medium wel kon groeien maar dat de originele vorm verdween. De ‘worstjes’ (staafvormige bacteriën) werden nu bolletjes (zie afbeelding 2). De celwand wordt dus aangetast door het antibioticum. Worden de bacteriën in een normaal (hypotoon; met een lagere osmotische waarde) medium in contact gebracht met penicilline dan verliezen ze hun celwand en barstten ze door de instroom van water. De intacte celwand voorkomt normaal het knappen van de cellen door tegendruk te bieden aan het instromende water.

Verder onderzoek toonde aan dat penicilline een essentiële stap in de verknoping van de celwand verstoort, waardoor de celwand zo zwak wordt dat ze de druk van het naar binnen gutsende water niet meer kan weerstaan.

Meer dan een mechanisme

Andere antibiotica hebben een geheel andere manier om hun doeleiwit te remmen. Zo veranderen de meeste eiwitsyntheseremmers niets aan hun doeleiwitten, maar binden ze zo sterk aan hun doelwit dat het eiwit bepaalde functies niet meer kan uitvoeren. De binding van bijvoorbeeld streptomycine aan zijn doelwit, het ribosoom, verstoort de verlenging van de te maken eiwitketens, doordat het ribosoom minder goed onderscheid kan maken tussen tRNA moleculen die van essentieel belang zijn voor de vertaling van mRNA in aminozuren. Binding van streptomycine verhoogt de foutenfrequentie van het ribosoom dan ook, van 1:10.000 naar 1:500. Dit betekent dat bij een gemiddelde eiwit lengte van 250 aminozuren, de helft van de afgeleverde eiwitten een fout bevat. Die hoeveelheid onwerkzame eiwitten belemmert het functioneren van de cel, waarna deze sterft.

Het waarom van antibiotica

Een vraag die men zich sinds de ontdekking van antibiotica-producerende bacteriën heeft gesteld is het waarom van deze antibiotica-produktie. Deze bacteriën moeten namelijk speciale voorzorgen nemen, om niet door hun eigen produkten te worden omgebracht. Verschillende hypothesen zijn in de loop der jaren opgesteld en hieronder volgen er een paar.

Overschot

Een van de elegantere hypothesen ziet antibiotica als ware het ‘overschotmoleculen’ van een onder druk staand metabolisme of ongebalanceerde groei. Hierbij kunnen tussenproducten van reacties niet snel genoeg worden omgezet in het eindprodukt en worden deze dan maar omgezet in een verder nutteloos molecuul. Sinds de opkomst van de moleculaire genetica is dit geen houdbare positie meer, want het blijkt dat er wel degelijk kosten aan de antibioticaproduktie verbonden zijn.

Een kostbare zaak

Om inzicht te verschaffen in de kosten van antibioticaproduktie voor de betreffende organismen, enige feiten over de produktie van tylosine, een eiwitsyntheseremmer uit Streptomyces fradiae. Het genoom van S. fradiae bevat twee resistentiefactoren, 5 genen (bij elkaar 41.000 baseparen) voor het centrale eiwitcomplex, nog eens 17 bijkomende synthesegenen voor zijketens en dergelijke en nog een groep genen die het geheel dient te reguleren. Alles opgeteld komt dat neer op 85 kbp (kilo baseparen), 1% van het genoom! Daarbij dienen waarschijnlijk nog een aantal op dit moment onbekende genen te worden opgeteld. De produktie van een antibioticum is dus alles behalve een metabool ongelukje! Al deze getallen wijzen op een belangrijke functie van het antibioticum voor de producent! Maar wat zou dit kunnen zijn?

Chemische oorlogvoering of praatgroep?

Een populaire gedachte behelst het gebruik van antibiotica als chemisch wapen in de strijd om het bestaan. Als Penicillium chrysogenumsporen op een lekkere kaas landen, gaan ze deze gebruiken als voedingsbodem. Nu is het voorstelbaar dat bacteriën die tegelijkertijd op deze kaas gaan groeien niet welkom zijn. Niet alleen omdat ze beroerde tafelmanieren hebben, maar ook omdat het voedsel belangrijk is voor de overleving en voortplanting van de schimmel. Om dit voedsel veilig te stellen vergiftigt Penicillium de kaas maar alvast, zodat de bacteriën niet verder kunnen groeien. Omdat P. chrysogenum zelf nog wel van het zojuist vergiftigde voedsel moet kunnen eten, heeft de schimmel gedurende de evolutie een selectief vergif ontwikkeld, dat volstrekt ongevaarlijk is voor de producent zelf. Dit lijkt vrij duidelijk.

Bij de meeste streptomyceten ligt deze hypothese wat moeilijker, vooral omdat nooit voldoende hoge lees dodelijke concentraties in het leefmilieu van de producenten zijn aangetoond. Een probleem bij het bedenken van een geschikte hypothese is het generaliserende karakter van een hypothese die begint met de woorden “Antibiotica dienen….”. Het bestaan van grote structuurverschillen tussen verschillende antibiotica kan wel eens wijzen op een zeer wijd spectrum aan functies voor deze moleculen. De enige overeenkomst van dit soort moleculen is dat ze giftig zijn voor (sommige) organismen maar dat zou best wel een toevallig ‘ongeluk’ kunnen zijn.

Antibiotica zijn namelijk onderdeel van een veel grotere klasse van moleculen die gezamenlijk de secundaire metabolieten heten. Dit zijn moleculen die niet essentieel zijn voor normale cellulaire groei of voortplanting. Ze komen in alle rijken van het leven voor. Niet alle secundaire metabolieten zijn antibiotica; sommige veroorzaken hallucinaties in mensen, andere zijn anderszins farmacologisch actief, weer andere schijnen absoluut geen voor mensen interessante eigenschappen te hebben. Het enige dat vele antibiotica onderscheidt van andere secundaire metabolieten is dat de producent voorzorgen dient te nemen, opdat het organisme zelf niet vergiftigd wordt.

Onderzoekers moeten dus niet denken dat wanneer voor een antibioticum een functie wordt gevonden dit meteen de vraag naar de functie van andere antibiotica oplost. Daarom is het misschien beter te spreken over een functie van een specifiek antibioticum. Zo is van het niet klinisch toepasbare antibioticum thiostrepton gevonden dat het de expressie van enkele genen in streptomyceten (een groep bodembacteriën) verandert.

Recenter onderzoek aan veel meer genen en met meer soorten antibiotica in Salmonella liet zien dat blootstelling van de bacterie aan zeer lage concentraties antibioticum de expressieniveaus van ongeveer 5% van het totaal aantal genen verandert. Zou het kunnen dat bodembacteriën elkaars genexpressie, ten goede of ten kwade, beïnvloeden door het afscheiden van zeer kleine hoeveelheden antibiotica? Misschien communiceren de bacteriën zo met elkaar. Nu is het niet zo dat de bacteriën al babbelend door het leven gaan, maar ze houden elkaar wel op de hoogte van hun welzijn en aantal.

Deze communicatie is bekend bij sommige bacteriën, hoewel nog niet is aangetoond dat antibiotica hier een rol bij spelen. Het elkaar op de hoogte stellen van het aantal buren gebeurt door het uitscheiden van een molecuul dat alle bacteriën meten; hoge concentraties van dat molecuul wijzen op grote hoeveelheden bacteriën. Op basis daarvan ‘besluiten’ de bacteriën bijvoorbeeld hun gastheer te infecteren. Dit fenomeen is bekend onder de naam Quorum-sensing. Het gebruik van een antibioticum in deze context is zoals gezegd nog niet waargenomen. De veranderde genexpressie wijst echter op een dergelijke functie. De communicatie-hypothese maakt het dan aannemelijk dat het antibiotisch effect per ongeluk is.

Penicilline, gemaakt door een schimmel, die er zelf geen last van heeft, omdat schimmels geen peptidoglycaan (hoofdbestanddeel van de bacteriële celwand) bevatten, lijkt echter vrij duidelijk bedoeld als chemisch wapen. De producent elimineert op deze wijze de concurrentie van snelgroeiende bacteriën die hetzelfde voedsel gebruiken. Het mag duidelijk zijn dat een eenduidig antwoord op de algemene vraag over het waarom van antibiotica nog op zicht laat wachten. Kortom, wij weten het (nog) niet.

Penicilline – Van dichtbij bekeken

De celwand van bacteriën als Staphylococcus aureus, een bekende veroorzaker van ziekenhuisinfecties bij patiënten, is eigenlijk een groot molecuul van in elkaar verstrengelde peptiden en suikerketens dat als een ‘jas’ om de cel heen zit. Een belangrijke reactie in de vorming van deze celwand is het aaneenknopen van twee korte aminozuurketens door het enzym glycopeptide transpeptidase. De aldus gevormde brug is bepalend voor de sterkte van de celwand.

Nu gaan chemische reacties in cellen meestal nooit vanzelf, maar worden ze gekatalyseerd (versneld) door enzymen. Enzymen versnellen reacties door de reagerende stoffen (substraten) in hun katalytisch centrum bijeen te brengen en te vervormen, waardoor ze eerder zullen reageren. Vaak reageert een enzym zelfs met een van de substraten en komt dan later weer vrij. Dit geldt ook voor het glycopeptide transpeptidase, zoals te zien is in de afbeelding, waarbij een Serine uit het katalytisch centrum reageert met een van de substraten.

Zelfmoord

Als penicilline vergeleken wordt met het eerste substraat, terwijl het in het katalytisch centrum van een transpeptidase zit, dan valt op dat bepaalde bindingen erg op elkaar lijken. Zo sterk zelfs dat het transpeptidase penicilline behandelt als ware het een normaal substraat. De koolstofatomen van de vijfring houden de C-N binding van penicilline steeds in een bepaalde positie, die lijkt op de C-N positie van het tetrapeptide. Penicilline doet zich als het ware voor als een legitiem substraat voor het transpeptidase en bindt dan ook sterk aan het enzym.

Dat enzym voert vervolgens getrouw de reactie uit die tot zijn katalytische dood leidt: het verbreekt de binding tussen het koolstof- en stikstofatoom in de beta-lactamring, waarbij een aminozuur van het enzym gebonden wordt aan het koolstofatoom. Vervolgens wacht het enzym tot een pentapeptide binnenkomt om het substraat over te nemen. Dit komt echter niet, omdat de thiazolidinering van penicilline nog steeds via een C-C binding gebonden is aan het enzym en zo als het ware het katalytisch centrum verstopt.

Het enzym is nu inactief, crosslinks worden niet meer gemaakt waardoor de celwand geen tegendruk meer biedt aan het instromende water. De bacterie zwelt op en barst. De manier waarop het glycopeptide transpeptidase zelf zijn katalytisch einde bewerkstelligt is kenmerkend voor een groep enzymremmers en wordt aangeduid met zelfmoord. Zo’n remmer heet dan zelfmoordremmer (of in het Engels suicide inhibitor).

Bronnen:

L. Stryer. Biochemistry The Ribosome; Structure, Function, Antibiotics and Cellular Interactions (ASM Press)

Ee-Been Goh, Grace Yim, Wayne Tsui, JoAnn McClure, Michael G. Surette, and Julian Davies. (2002) “Transcriptional modulation of bacterial gene expression by subinhibitory concentrations of antibiotics”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, Issue 26, p17025-17030