Eten moet niet alleen lekker zijn, maar er ook lekker uitzien. Grijze limonade is niet lekker, en snoepjes die naar citroen smaken horen geel te zijn. Om die reden zitten er in veel etenswaren toegevoegde kleurstoffen, denk maar aan toetjes, snoepjes en ijsjes. Niet alleen zoetigheid maar bijvoorbeeld ook kaas en vlees, wordt vaak bijgekleurd. Vaak hebben kleurstoffen een natuurlijke oorsprong, maar worden ze chemisch oftewel synthetisch geproduceerd. Tegenwoordig probeert men ze op een “groene” manier te produceren door bacteriën of gisten de gewenste kleurstof te laten maken. In dit artikel bespreek ik hoe de gele kleurstof annatto, die eigenlijk gewonnen wordt uit plantenzaden, gemaakt kan worden in een bacterie.

Kleurstoffen

Natuurlijke kleurstoffen in duurzame producten

Meestal zijn natuurlijke kleurstoffen afkomstig uit planten. Voorbeelden zijn saffraan (uit krokus), curcumine (uit geelwortel), annatto (uit de annatto zaadjes), anthocyanen (uit biet en rode vruchten), lycopeen (uit tomaat) en luteïne (uit brandnetels en afrikaantjes). Het nadeel van deze pigmenten is dat het erg duur is om ze uit de natuurlijke bron te winnen. Daarom worden ze vaak toch synthetisch geproduceerd. In dat geval zijn het geen natuurlijke kleurstoffen, maar worden ze “natuur-identiek” genoemd. Vaak zijn de natuur-identieke stoffen goedkoper, maar hebben ze als nadeel dat ze niet op een duurzame manier gemaakt zijn (d.w.z. de fabriek waar het gemaakt wordt produceert chemisch afval). Nog een nadeel is dat er bijvoorbeeld nog spoortjes van oplosmiddelen en katalysatoren in kunnen zitten, die giftig kunnen zijn.

Veel consumenten moeten niets hebben van kunstmatige kleurstoffen, ook al zijn ze natuur-identiek. Vandaar dat veel voedselproducerende bedrijven toch liefst “natuurlijke” toevoegingen gebruiken. Wat verstaat men onder “natuurlijk”? Internationaal wordt als “natuurlijk” gezien, alles wat met alleen natuurlijke hulpbronnen in een keuken zou kunnen worden gemaakt. Daar mag dus geen enkel synthetisch product of hulpmiddeltje aan te pas komen. Fermenteren en omzettingen met enzymen zijn bijvoorbeeld natuurlijke processen (neem bierbrouwen) maar chemische koppelingen die stoffen omzetten met behulp van katalysatoren of reactieve chemicaliën (die hetzelfde resultaat kunnen hebben) zijn niet natuurlijk. Zonnebloemolie, graan en hout, en alle dingen die je daar in een keuken uit kunt halen (door destillatie of koken bijvoorbeeld), zijn natuurlijke grondstoffen. Formaldehyde, benzeen en dergelijke stoffen die meestal uit aardolie gemaakt worden, en producten van die stoffen (zoals bijvoorbeeld iononen: dat zijn stoffen die in rozengeur voorkomen, maar meestal chemisch gemaakt worden) zijn niet natuurlijk.

Of een toevoeging werkelijk natuurlijk is wordt meestal via certificering gecontroleerd. Eventueel kan de aanwezigheid van synthetische kleurstoffen bepaald worden door de verhouding C12:C13 atomen in een stof te analyseren. Koolstof kan als C12 of als C13 isotoop voorkomen in de CO2 in de lucht, en deze twee isotopen komen allebei voor in natuurlijke en niet-natuurlijke producten. Een natuurlijk product zal minder C13 isotopen bevatten omdat de enzymen die dit product maken een voorkeur hebben om C12 te gebruiken. Chemische synthese heeft geen voorkeur voor C12 of C13, en een niet-natuurlijk product zal dus relatief veel C13 bevatten. Bepaalde laboratoria zijn gespecialiseerd in dit soort analyses, en kunnen beoordelen of een stof natuurlijk is of niet. Als in een product alleen natuurlijke stoffen verwerkt zijn mag dat op het etiket. De EU heeft nogal strikte richtlijnen bepaald in welke gevallen dat wel mag, en in welke gevallen niet.

Van plant naar bacterie

De meest natuurlijke bron voor een natuurlijke kleurstof is natuurlijk de plant waar het van nature in voorkomt. Toch wordt er in toenemende mate geprobeerd om de plantaardige bronnen te vervangen voor micro-organismen zoals bacteriën en gisten. Dat lijkt in strijd met het “natuurlijkheids”-beginsel, maar kan toch bepaalde voordelen hebben. Het belangrijkste voordeel is het feit dat een kleurstof nooit als zuiver stofje uit de plant komt en dat is wel het geval als je het in een bacterie produceert. In een plantenextract is er vaak één stof verantwoordelijk voor de kleur maar zitten er nog een heleboel (soms duizenden) andere stoffen bij. Hoeveel andere stoffen er nog in het extract zitten is afhankelijk van de extractiemethode en hoe zorgvuldig die uitgevoerd wordt. Eigenlijk zou je willen dat van alle stoffen in het gezuiverde extract bekend is dat die veilig gegeten kunnen worden. Daar ligt een voordeel van een micro-organisme: bakkergist of yoghurtbacteriën worden al eeuwenlang straffeloos gegeten, en er is zeer uitgebreid uitgezocht of die een effect op de gezondheid hebben. Als van zo’n micro-organisme eenmaal bepaald is dat het “GRAS” ( Generally Recognized As Safe) is, kun je die voor een groot aantal doelen inzetten. Je kunt bijvoorbeeld proberen het micro-organisme natuurlijke kleurstoffen te laten maken, die normaal uit planten gezuiverd moeten worden. Dan kun je een goedgekeurde stof in een goedgekeurde bacterie maken. In dat geval hoef je niet voor elk verschillend extract weer uit te zoeken of er stoffen in voorkomen die niet eetbaar zijn. Een kleurstof die door een goedgekeurd micro-organisme wordt gemaakt kan best onzuiverheden (stoffen die niets met de kleurstof te maken hebben) bevatten, maar daar kun je tenminste zeker van zijn dat die niet schadelijk zijn voor de gezondheid. Een andere overweging om kleurstoffen in micro-organismen te maken kan zijn dat het goedkoper is, of dat de kwaliteit of de aanvoer constanter is.

Annatto

Van een aantal kleurstoffen wordt nu uitgezocht hoe je ze in bacteriën zou kunnen maken. Een voorbeeld waarbij dat recent gelukt is is annatto. Annatto is van oorsprong een kleurstof die de indianen van Zuid Amerika in hun eten verwerken en op hun lichaam aanbrengen als een soort body-paint. Tegenwoordig zit het in bijna alle gele kazen en wordt het veel gebruikt in ijsjes en vla. Het wordt gewonnen uit de zaden van de annatto plant Bixa orellana, zie afbeelding 2) die vooral in Zuid Amerika groeit. De kleurstof zit in de zaden van die plant. Om deze “natuurlijke” kleurstof uit die zaden te krijgen is nogal een ingewikkelde extractie nodig. Eerst wordt de kleur door te verzepen met loog uit de zaadhuiden gehaald. Daarna laat men de stof uitvlokken en volgen er nog stappen om te ontvetten, concentreren onder vacuüm en vriesdrogen, om het uiteindelijke pigment in handen te krijgen. Rond 5% van de zaadhuid bestaat uit kleurstof.

De extractie van het pigment is een ruw proces. Het is erg onwaarschijnlijk dat alle andere stoffen die zich in die zaadhuid bevinden verwijderd zijn na dit proces. Ook kan de extractiemethode voor chemische veranderingen van deze stoffen zorgen. Het spreekt voor zich dat dit niet allemaal tot in detail is uitgezocht, laat staan dat we de effecten begrijpen die zulke stoffen op je gezondheid hebben. Van bixine, de kleurstof uit het annatto pigment, weten we vrij veel. De chemische structuur van bixine staat afgebeeld in afbeelding 3. De gele kleur wordt veroorzaakt door de dubbele bindingen in het molecuul. Bixine hoort bij de groep van de carotenoïden, dat zijn stoffen die verwant zijn aan caroteen, de bekende oranje kleur in worteltjes. In alle planten zitten dergelijke stoffen, en ook de roze kleur van zalm, kreeft en flamingo’s komt van een carotenoïde, die deze dieren opnemen door algen te eten.

Rode en gele bacteriën

Om bixine in bacteriën te maken moet er heel wat gesleuteld worden aan het genenpakket van die bacteriën. Eerst is het belangrijk dat de bacterie lycopeen gaat maken. Lycopeen is een soort basis-caroteen (zie afbeelding 3) die bijvoorbeeld in tomatenschillen de rode kleur veroorzaakt. Lycopeen kan gemaakt worden uit IPP, een stof die wel in de bacterie voorkomt. Om IPP om te zetten in lycopeen zijn drie nieuwe enzymen nodig, die niet in de bacterie voorkomen. Die enzymen komen wel in planten en in sommige niet-eetbare bacteriën voor. De genen die die enzymen maken kunnen makkelijk overgezet worden uit die planten via moderne biotechnologie. Die drie enzymen zetten stap voor stap lycopeen in elkaar, en een bacterie waarin die drie enzym-genen gebracht zijn is dan ook rood. Dit is in 1990 al gelukt (zie bron nr. 3). Om de tweede stap mogelijk te maken moet lycopeen verder omgezet worden, ook weer met behulp van enzymen. Van dat soort enzymen zijn al een aantal voorbeelden bekend, die niet algemeen zijn, maar uit zeer diverse bronnen gehaald worden. Voor caroteen is nog maar een enzym nodig, en voor asthaxanthine, de stof die in algen wordt gemaakt en in kreeften voorkomt zijn nog twee extra enzymen nodig (zie afbeelding 3). Om van lycopeen het bixine te maken zijn weer drie enzymen nodig. Deze enzymen komen waarschijnlijk alleen in de annatto plant voor, en ze zijn pas dit jaar ontdekt door de onderzoeksgroep van Bilal Camara in Straatsburg (zie bron nr. 2).

Enzymen ontdekken

Enzymen worden ontdekt door eerst wat ruwe plantenextracten te testen. Men heeft eerst de annatto zaden gemalen, en er lycopeen bijgedaan. In dat mengsel wordt het eindproduct bixine gemaakt, en een aantal tussenproducten. Als je weet wat voor tussenproducten er gevormd worden, kun je de aard van de betrokken enzymen beschrijven. In het geval van annatto verwachtte men op deze manier een enzym dat carotenen knipt (een dioxygenase), een enzym dat een methylgroep ergens aanhangt (methyltransferase) en een enzym dat waterstofgroepen verwijdert (dehydrogenase). Deze enzymen worden in de zaden gemaakt door de daar aanwezige genen. In dat zaad kunnen duizenden genen tot expressie komen, en de goeie genen heb je dus niet zomaar te pakken. Een goed hulpmiddel daarbij zijn genen uit andere planten waarvan bekend is dat ze voor een dioxygenase, methyltransferase of dehydrogenase coderen. Met wat probeerwerk worden dan vergelijkbare genen uit de Annatto plant gehaald. Met die genen kunnen de enzymen in bacteriën gemaakt worden en daarmee kan getest worden of die ook inderdaad de verwachtte omzettingen van lycopeen naar de voorlopers van bixine verzorgen. Zo zijn de drie genen gevonden die nodig zijn om te zorgen dat een bacterie van lycopeen bixine kan maken. En inderdaad: als de onderzoekers een bacterie voorzien van zowel de drie genen voor het maken van lycopeen, als de drie genen voor het omzetten van lycopeen tot bixine, dan maakt die bacterie bixine.

Bacterie-annatto in de kaas?

Zo is het nu dus mogelijk annatto in een microbieel productiesysteem te maken. Dit systeem bestaat uit een bacterie die groeit op suiker en deze omzet in annatto. Dit kan deze bacterie omdat hij (via biotech) dezelfde enzymen kan maken als de plant van nature heeft. In principe zou annatto nu dus ook in een Europese fabriek kunnen worden gemaakt, in plaats van in een Zuid-Amerikaanse plant. Ik wil benadrukken dat dat nog niet het geval is, en dat de groep van Camara niet claimt dat ze hun uitvinding willen commercialiseren. Toch is het leuk om na te denken of dit een goed concept zou zijn. Je kunt er zeker van zijn dat een aantal bedrijven dat ook doen! Er zijn al voorbeelden van bedrijven die vergelijkbare dingen doen: Genencor, een bedrijf dat onder andere in Leiden gevestigd is, heeft bijvoorbeeld bacteriën die Indigo (de blauwe kleurstof voor spijkerbroeken) produceren (zie bron nr. 1).

Voordat het bacterie-annatto echt in eten wordt verwerkt zullen een aantal vragen belangrijk zijn. Ik stel een paar discussiepunten aan de orde, waarvan ik zelf vind dat het leuk is om over na te denken.

Ten eerste is er de economische vraag. Annatto is nooit een echte kaskraker geweest. In de jaren 80 van de vorige eeuw is het even duur geweest (US$ 2500 per ton zaad). Toen zijn er een heleboel bomen aangeplant op plantages in Zuid Amerika en Afrika, die drie jaar later zaad begonnen te produceren. Een aantal van die bomen produceert inferieur zaad, waar veel te weinig bixine in zit. De boeren met die bomen zijn natuurlijk tot armoede vervallen, omdat hun gewassen niets opbrengen. Ook van kwalitatief goed zaad is er voldoende te krijgen op de wereldmarkt, het kost nu nog maar ongeveer 400 $/kg (gegevens FAO). De vraag is of een productiesysteem met bacteriën in Europa met die prijs kan concurreren. Deze vraag is belangrijk voor bedrijven die annatto op die manier willen gaan produceren.

Ten tweede is er een kwaliteitsvraag. De kwaliteit van het product is belangrijk: Is de bacterie-annatto net zo goed als de echte annatto? Zijn er geen nadelige bijproducten aanwezig, die bijvoorbeeld een vies luchtje meebrengen? Deze vraag is belangrijk voor de verwerkende industrie, bijvoorbeeld de kaasmakers.

Ten derde zou je je kunnen afvragen of bacterie-annatto wel natuurlijk genoeg is: de EU definieert zo’n bacterieel-geproduceerde kleurstof wel als natuurlijk, maar vinden consumentenorganisaties dat een bacterie met vreemde genen wel een natuurlijke bron? De technische kwaliteit is wellicht goed, maar wordt het ook door de consument gewaardeerd? Over het toepassen van biotechnologie voor voedselproducten is een maatschappelijke discussie gevoerd, die overigens niet heel erg intensief beleefd is door de bevolking. Consumenten reageren over het algemeen niet erg positief op biotechnologie, maar het kan ze in de praktijk vaak niet veel schelen, zeker als het goedkoop is. In het geval van kleurstoffen denk ik daarom dat dit probleem niet heel belangrijk wordt: Mensen die bacterie-kleurstoffen niet wensen te eten, willen in veel gevallen waarschijnlijk helemaal geen kleurstoffen in hun eten. Toch kan deze vraag belangrijk zijn voor consumentenorganisaties.

Ten vierde is er een sociaal aspect: Is het ethisch om biotechnologie toe te passen als je daar Zuid-Amerikaanse boeren brodeloos mee maakt? Aan de ene kant zijn dit nu de harde economische wetten: als je het elders goedkoper kan krijgen, moet je dat zeker niet laten. Aan de andere kant zou je kunnen vinden dat het niet helemaal eerlijk is als de Annatto plant uit Zuid-Amerika genen zou leveren aan een bacterie, die vervolgens die plant en de boeren overbodig maken. De vraag is of dit een omvangrijk probleem is (Gaan er boeren dood van de honger of gaan ze gewoon wat anders verbouwen? Heeft de annatto plant een hele belangrijke plaats in het ecosysteem van Zuid-Amerika?). Dat bepaalt, samen met de “aaibaarheid” van de zaak, denk ik of NGO organisaties als Greenpeace of Novib zich er mee bezig gaan houden.

Ten vijfde (en misschien wel als belangrijkste) speelt het milieu ook een belangrijke rol: bacteriële productie vervangt niet alleen de plantaardige productie, maar maakt ook de chemische zuivering en de chemische productie van niet-natuurlijke kleurstoffen overbodig. Wat dat betreft lijkt het in ieder geval schone technologie. Deze vraag is vooral voor de overheid en de EU belangrijk.

Zo zie je maar, met het vinden van een paar genen kun je jezelf een hoop vragen stellen. De komende jaren zullen er veel van dit soort vondsten gedaan worden. Zodra er een aantal gecommercialiseerd worden zullen waarschijnlijk een aantal van de vragen beantwoord worden.

Bronnen:

1. Berry A, Dodge TC, Pepsin M & Weyler W (2002) Application of Metabolic Engineering to improve both the production and use of Biotech Indigo. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 28:127-133. 2. Bouvier F, Dogbo O & Camara B (2003) Biosynthesis of the food and cosmetic plant pigment bixin (annatto). Science 300: 2089-2091. 3. Misawa N, Nakagawa M, Kobayashi K, Yamano S, Izawa Y, Nakamura K & Harashima K. (1990) Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. Journal of Bacteriology 172(12):6704-12.