Je leest:

Bacteriële biodiversiteit in de bodem

Bacteriële biodiversiteit in de bodem

Auteur: | 25 september 2003

Moleculaire detectietechnieken op basis van essentiële genen die in alle bacteriën voorkomen worden gebruikt om de bacteriële biodiversiteit te achterhalen. Zo kun je detecteren dat in nutriëntarme gronden de biodiversiteit afneemt naarmate je dieper in de bodem komt. Maar bijvoorbeeld ook dat langs de wortel van een plant de bacterie-aantallen een regelmatig golvend patroon vertonen.

Als je op je blote voeten in het gras staat sta je er niet bij stil dat er onder je al snel enige miljarden bacteriën in de bodem zitten. Hoe pak je het aan als je deze zou willen determineren? Hoe zitten ze eigenlijk verspreid door de grond? Met moleculair biologisch speurwerk zijn nu zelfs de niet-kweekbare bacteriën op te sporen.

Microbiologie en Biodiversiteit

Biodiversiteit is een van de modewoorden in de biologie van de afgelopen jaren. Met biodiversiteit bedoelen we vaak de soortenrijkdom of de aanwezige hoeveelheid variatie. Hierbij kunnen we het hebben over de genetische diversiteit – de verschillen op DNA niveau – binnen één soort, maar ook over de verscheidenheid aan verschillende soorten op één locatie of over de verschillende habitats en milieus die we kunnen onderscheiden. Waarbij een zo groot mogelijke biodiversiteit als ideaal wordt gezien.

De microbiologie is de tak van de biologie die zich bezighoudt met micro-organismen zoals bacteriën en schimmels. Bacteriën zijn kleine eencellige organismen, die we alleen met de sterke vergroting van een microscoop of zelfs van een elektronenmicroscoop kunnen waarnemen (afbeelding 1). De eerste circa 150 jaar heeft de microbiologie zich voornamelijk beziggehouden met het kweken en de kweekomstandigheden van de micro-organismen. Met de ontdekking van DNA en de opkomst van de moleculaire biologie de afgelopen jaren, wordt er echter ook steeds meer moleculair werk aan micro-organismen gedaan. Dat is maar goed ook, want nu blijkt dat slechts voor naar schatting 1-20% van de bacteriën we de kweekomstandigheden voldoende weten na te bootsen dat we ze daadwerkelijk kunnen kweken. Daarna kunnen we ze op de klassieke manier bestuderen en dat houdt in dat we naar de groeikenmerken zoals het gebruik van bepaalde voedingsstoffen kijken. Ook het bestuderen van de vorm met de microscoop en het uitpluizen van de biochemische samenstelling van de bacterie vallen onder de klassieke manier. Bovendien blijkt dat van de bacteriën die we wél kunnen kweken vaak een groot deel om een onbekende reden fysiologisch toch niet in staat is om direct te groeien op de bekende kweekmedia.

Afb. 1. Een foto van bodembacteriën op de (op de foto grijsgetinte) wortel van gerst, gemaakt met een 3D scanning-laser microscoop. De groene cellen zijn Pseudomonas fluorescens bacteriën die oplichten dankzij ‘green fluorescent proteins’. De lichtblauwe cellen zijn allerlei andere bodembacteriën die met de kleurstof DAPI zijn gekleurd. Pseudomonas fluorescens is een bacterie die dankzij de productie van verschillende antibiotica sommige plantenziektes kan bestrijden. bron: Bo Normander

Tegenwoordig zijn we in staat om de totale volgorde van de bouwstenen waaruit het DNA van een organisme bestaat uit te pluizen en er wordt dan ook regelmatig melding gemaakt dat er weer een ‘genoom’ totaal gesequenst is. In dit stuk ga ik het echter niet hebben over de mogelijkheid die we hebben met de huidige moleculaire technieken om meer te zeggen over één soort, maar over de mogelijkheden die er zijn om meer te zeggen over hele populaties van grotendeels niet kweekbare bacteriën. En in het bijzonder over de ‘bacteriële biodiversiteit in de grond’. Want heb je er wel eens bij stil gestaan dat in een gram grond al snel enige miljoenen bacteriën zitten en dat we daar eigenlijk nauwelijks iets van afweten?

Moleculaire Technieken in de Bacteriële Ecologie

Alle cellen bevatten ribosomen, die essentieel zijn om het DNA via RNA te vertalen in de eiwitten en enzymen die de cel nodig heeft om te kunnen leven. Omdat er in een cel veel ribosomen nodig zijn, zijn er in het genoom van de cel veel kopieën van de ribosoom-genen te vinden. Omdat deze genen zo belangrijk zijn voor de cel, zal een mutatie in deze genen vaak de overlevingskansen van een cel verminderen en snel door de competitie met gezondere cellen verdwijnen uit de populatie. Miljoenen jaren selectie heeft ervoor gezorgd dat de ribosomale genen in bacteriën wel wat variatie hebben opgelopen, maar toch voor het overgrote deel sterk ‘geconserveerd’ zijn. Deze geconserveerde overeenkomsten in de ribosomale genen kunnen we gebruiken om stukken ribosomale genen op te pikken. Dit stuk kunnen we daarna verder analyseren. Een pure culture van slechts 1 soort zal geen variatie laten zien, een mengsel van bacteriesoorten dus wel. De variatie in de opgepikte ribosomale fragmenten geeft ons dus een idee van de hoeveelheid en verhouding van verschillende aanwezige soorten. Dat die ribosomale genen in iedere cel bovendien in veelvoud aanwezig zijn, maakt ze makkelijker te detecteren dan genen die maar in enkelvoud aanwezig zijn.

Hoe gaat dit bekijken van variatie binnen genen nu precies? Bij bekende bacteriesoorten is gekeken naar de sequentie van het ribosomale 16S DNA gen. Veel van deze sequenties zitten zelfs in vrij toegankelijke databases op het internet. Door deze genen van verschillende bacteriesoorten met elkaar te vergelijken werd duidelijk dat er geconserveerde en variabele stukken in het gen zitten. Sommige van die geconserveerde stukken lijken zelfs zo sterk geconserveerd dat zij in alle soorten hetzelfde zijn. De variabele stukken geven de bacterie ‘zijn gezicht’ en de geconserveerde stukken kunnen we gebruiken om dat stuk ribosomaal gen te vermenigvuldigen. Want om het ribosomale gen te kunnen bekijken hebben we wel een heleboel kopieën nodig. Dat kopieren gaat met de zogenaamde PCR-methode ( polymerase chain reaction). Met behulp van DNA-primers (stukjes van zo’n 15-20 nucleotiden lang) markeren we het begin en het einde van het gen. Hierna vindt de transcriptie (het kopiëren) plaats. Dit vermeerderen gebeurt met behulp van enzymen, net zoals dit in iedere delende cel van nature gebeurt. Met iedere kopieerstap verdubbelen we het aantal kopieën van het ribosomale gen van een aanwezige bacterie. Na dertig herhaalde reacties hebben we zo van één dubbelstrengs 16S DNA gen naar schatting zo’n 230 exemplaren gemaakt. Dit is voldoende om het DNA verder te analyseren.

Er zijn verschillende manieren om daarna de variatie in de sequenties te bekijken. Zo kan men hele fragmenten totaal gaan sequensen en op grond van de verschillen in nucleotiden-volgorde in het DNA concluderen dat men verschillende soorten heeft. Maar het is niet per se nodig de precieze volgorde te kennen om de verschillen eruit te vissen. Een andere techniek, de ‘RFLP’-methode (restrictie fragment lengte polymorfie) knipt het variabele gedeelte in kleine stukjes met zogenaamde restrictie-enzymen waarna de verschillende stukjes DNA op grootte gescheiden worden met behulp van gel-elektroforese zodat een specifiek bandenpatroon onstaat. Weer andere technieken (zoals bij voorbeeld DGGE, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) maken bijvoorbeeld gebruik van het feit dat verschillende DNA sequenties andere fysische eigenschappen hebben: normaal komt DNA voor als twee in elkaar gedraaide strengen oftewel ‘dubbelstrengs’. Door bijvoorbeeld verhoging van de temperatuur of oplopende concentraties van bepaalde stoffen (bijvoorbeeld ureum en/of formamide) kan het dubbelstrengs DNA opsplitsen in twee enkele strengen. Dat enkelstrengs worden heet denatureren. Nu zijn de verbindingen in het DNA die gevormd worden door de nucleotiden Guanine (G) en Cytosine © sterker dan die gevormd door Adenine (A) en Thymine (T). Een DNA sequentie met veel meer G’s en C’s zal pas bij hogere temperaturen enkelstrengs worden dan een met veel A’s en T’s. Ook de volgorde van de verschillende nucleotiden is sterk bepalend voor de fysische eigenschappen van het DNA. Wordt een mengsel van fragmenten aan een gradiënt blootgesteld van oplopende temperatuur of denaturerende stoffen dan zullen ze op verschillende plaatsen uitsmelten en in de gel blijven zitten. Verschillende fragmenten kunnen dan duidelijk van elkaar onderscheiden worden. Afbeelding 2 laat een voorbeeld zien waarbij verschillende bacteriepopulaties op verschillende dieptes in een biologisch en conventioneel bewerkte grond zichtbaar zijn.

Afb. 2. Foto Gradiënt Gel. Op deze foto een gradiënt gel met een oplopende DNA-denaturerende gradiënt van ureum en formamide. In de lanen gemarkeerd met ‘marker’ is een mengsels van pure cultures darmbacteriën opgebracht, in ‘marker-c’ een mengsel van copiotrofe bodembacteriën (bacteriën die relatief grote hoeveelheden koolstof nodig hebben om te groeien). Het duidelijkste verschil is dat tussen de twee Conv-lanen met dieptemonsters uit een conventioneel bewerkte bodem en de andere lanen met monsters van biologisch bewerkte grond: in de biologische grond zijn meer verschillende DGGE banden waarneembar en zitten dus waarschijnlijk meer verschillende soorten bacteriën. Door de foto op een lichtbak te leggen en met speciale computerapparatuur zijn zo’n 30 tot 40 afzonderlijke fragmenten waar te nemen een deel daarvan is op de foto als duidelijke banden met het blote oog zichtbaar. Zo bevatte laan Conv BS-5 31 banden boven de gestelde detectielimiet en de naastgelegen laan Biol BS-24 36 banden.

In de volgende paragrafen staan een tweetal voorbeelden van hoe men met dergelijke technieken een idee krijgt van de biodiversiteit in een ondoorzichtig substraat als de bodem.

Bacteriële Biodiversiteit op Verschillende Dieptes in de Bodem

Om een idee te krijgen hoe de microbiële diversiteit varieert door de bodem en wat de redenen daarvoor zijn hebben Jizhong Zhou en zijn collega’s in de Verenigde staten op een viertal geografisch verschillende plaatsen drie bodemmonsters genomen op verschillende dieptes: aan het oppervlak, net onder het grondwaterniveau en tussen beide andere monsterpunten in. De hoeveelheden beschikbare nutriënten in de bodem verschilde per locatie en de aantallen bacteriën varieerden van zo’n 107 per gram grond aan de oppervlakte tot slechts enkele honderden per gram onder het grondwaterniveau.

Van ieder monsterpunt werd direct uit de bodem bacterieel DNA geïsoleerd en werden honderden of zelfs duizenden fragmenten afzonderlijk vermenigvuldigd. Op grond van de verkregen bandenpatronen van ieder apart DNA-fragmentje werd een schatting gemaakt van de aantallen verschillende voorkomende sequenties en ook bekeken hoeveel van de bemonsterde fragmenten dezelfde restrictiepatronen gaven. Zo kreeg men zowel een beeld van aantallen verschillende “taxonomische eenheden” (zonder te bewijzen dat dit afzonderlijke soorten zijn of niet) en de frequentie van deze eenheden in de populatie.

Afb. 3. Biodiversiteit op verschillende dieptes in de bodem op basis van de aantallen verschillende DNA fragmenten gedetecteerd met de RFLP-techniek (Restrictie Fragment Lengte Polymorfie). Hoe vlakker de curve des te homogener is de populatie: meer vergelijkbare aantallen verschillende soorten kunnen worden waargenomen. Bij een steilere curve (bijvoorbeeld curve C) zijn enkele soorten oververtegenwoordigd en neemt de biodiversiteit af. De monsters zijn genomen in gronden met een laag (voedselarm) en een hoog koolstofgehalte (voedselrijk) op verschillende dieptes, net onder het bodemoppervlakte, ondergronds en beneden het grondwaterniveau zo’n 3 tot 6 meter diepte. Duidelijk in deze grafieken is dat de biodiversiteit lager is onder het grondwaterniveau in de armere bodem in vergelijking met de rijke bodem Bron: Zhou et al., 2002

In Figuur 3 staat een aantal van Zhou’s resultaten weergegeven. Een vlakke curve geeft aan dat er veel verschillende fragmenten worden waargenomen en allemaal in zelfde lage frequenties. Een steil afnemende curve geeft aan dat er minder verschillende fragmenten waargenomen worden en dat deze bovendien ook in veel hogere frequenties in de totale bemonsterde populatie voorkomen: de biodiversiteit is hier lager. Daarnaast staat er in deze figuur ook een getal (de reciproque van de Simpson’s Index) dat een maat voor de biodiversiteit aangeeft. Hoe hoger deze reciproque index des te diverser is de bodem.

De resultaten van Zhou laten zien dat er in gronden met een hoog gehalte aan verschillende koolstofverbindingen tot op enige meters diepte een hoge bacteriële biodiversiteit gevonden kan worden. In de gronden onder het grondwaterniveau met veel minder koolstofverbindingen, waar de grond verzadigd is met water, neemt de biodiversiteit echter af, hier worden slechts enkele dominante soorten gevonden.

De auteurs dragen verschillende mechanismen aan die deze verdeling van bacteriën en biodiversiteit kunnen verklaren. Zo kan er sprake zijn van ruimtelijke isolatie in bodems die niet verzadigd zijn van vocht. In dat geval kan er plaatselijk genoeg vocht zijn om bepaalde bacteriën te laten groeien, maar is er niet genoeg vocht voor deze bacteriën om zich verplaatsen naar andere plaatsen met voldoende voedingsstoffen voor groei. Op die andere plekken in de bodem ontstaan er door het gebrek aan transportmogelijkheden dus andere populaties, in plaats van dat één mobiele soort overal de overhand kan krijgen en dus de biodiversiteit verlaagd. Een andere verklaring voor hun resultaten is dat in de nutriëntenrijke bodem de verschillende voedingsbronnen blijkbaar al zo heterogeen zijn dat zelfs in de verzadigde delen van de bodem er voldoende bronnen overblijven om tal van verschillende soorten de kans te geven te overleven. Elke bacterie kan daar wel voedingsstoffen vinden naar zijn zin, zonder daar een al te sterke competitie voor aan te hoeven gaan.

Bacteriepopulaties langs een Plantenwortel

Een ander voorbeeld van een studie naar de bodembacterie biodiversiteit is het eigen onderzoek naar de bacteriepopulaties in de omgeving van plantenwortels, de zogenaamde rhizosfeer. Ariena van Bruggen en haar medewerkers lieten zien met klassieke microbiologische kweektechnieken dat de absolute bacterieaantallen langs de wortel van de plant (graan) een regelmatig golfpatroon vertonen. Aan de groeitop van de wortel is een hoger aantal bacteriën waar te nemen dan in de omringende grond om de plant heen die niet onder de directe invloed van de plantenwortel staat. Langs de wortel omhoog neemt de populatie eerst af, dan weer toe en dit patroon wordt zo afhankelijk van de grond en de plantensoort iedere 20-25 cm aan wortel herhaald op een wortel van graan van zo’n 75 cm lang.

Met behulp van DGGE (zie hierboven) hebben we gekeken hoeveel verschillende ribosomale fragmenten we langs de plantenwortel en in de grond op enige centimeters van deze wortel kunnen ontdekken en in wat voor frequenties. Een voorbeeld van een DGGE gel staat in afbeelding 2. In iedere verticale laan is hier een ander grondmonster opgebracht. Per laan kunnen verschillende fragmenten onderscheiden worden op verschillende hoogtes die in principe van verschillende soorten afkomstig kunnen zijn. Sommige lanen laten duidelijk overeenkomstige banden zien, anderen bevatten heel specifieke banden. Ook de aantallen en de intensiteit van de banden (een maat van de frequentie van een band) variëren per monster.

Per grondmonster zijn op basis van de DGGE-gegevens schattingen gemaakt van de biodiversiteit van grond waar een graanplant staat: bijvoorbeeld door het aantal verschillende voorkomende fragmenten en dus mogelijke soorten te nemen als maat voor de biodiversiteit. Een voorbeeld hiervan staat in afbeelding 4, waar in rood de biodiversiteit staat uitgedrukt en in groen de aantallen bacteriën geteld op een arm (oligotroof) medium zoals bepaald langs een bemonsterde plantenwortel. Duidelijk is dat er langs de wortel een hele successie van bacteriën plaatsvindt.

Afb. 4. Fluctuerende biodiversiteit langs de wortel van graanplanten in biologische grond. In rood is de biodiversiteit uitgedrukt als de aantallen waarneembare verschillende bacteriële DGGE fragmenten. In groen is de fluctuatie weergegeven in de aantallen bacteriën geteld op een koolstofarm ‘oligotroof’ medium (niet op schaal: gemiddeld waren er zo’n 5,5×108 oligotrofe bacteriën per gram droge grond te vinden aan het worteloppervlak).

In tegenstelling tot wat werd aangenomen blijkt er langs de plantenwortel geen stabiele bacteriepopulatie te zijn maar één die duidelijk een regelmatig golvende beweging laat zien langs de plantenwortel omhoog. Deze populatiefluctuaties zijn onafhankelijk van ontstane zijwortel of van het vochtgehalte in de bodem. Er lijkt dus door alle uitgescheiden plantenstoffen aan de top van de wortel een groei en verandering van de lokale bodempopulatie in gang gezet te worden. Terwijl de wortel verder groeit, maakt de populatie een successie door waarbij groei en afname van het aantal bacteriën elkaar opvolgen. Volgens de DGGE analyses zijn sommige soorten voor een groot deel verantwoordelijk voor de groei, andere hangen samen met de afname van de populatiegrootte. Weer andere soorten blijken voornamelijk bij de worteltop of juist bij de stengelbasis van de plant voor te komen. De nieuwe analyse laat dus zien dat de bacteriën langs de wortel van de plant een heel dynamisch verloop hebben.

Ter afsluiting

In de bodem blijken dus veel meer bacteriën voor te komen dan we tot voor een aantal jaar konden vermoeden. Met de ontwikkeling van meer en nieuwere moleculaire technieken is het mogelijk om een idee te krijgen van de aanwezige biodiversiteit, waar we met de klassieke kweektechnieken slechts een tipje van de sluier konden oplichten. Tal van processen in de bodem zijn vermoedelijk de redenen dat de bodem zo divers is. In een homogene omgeving verwachten we door Darwin’s ‘survival of the fittest’ dat slechts de best aangepaste soorten overleven. Blijkbaar is grond juist een zeer heterogeen geheel. Ook de beschikbaarheid van verschillende soorten nutriënten kan verschillende bacteriesoorten de mogelijkheid geven naast elkaar voor te komen. De groeiomstandigheden in de grond kunnen op kleine schaal enorm van elkaar verschillen, bijvoorbeeld door verschillen in hoeveelheden vocht, waardoor er naast elkaar verschillende microklimaten voorkomen, elk met hun eigen soorten. Al met al speelt er daar onder onze voeten heel wat meer af, dan we op het eerste gezicht zouden vermoeden.

Bronnen

Treves, D.S., B. Xia, J. Zhou en J.M. Tiedje (2003) A two-species test of the hypothesis that spatial isolation influences microbial diversity in soil. Microbial Ecology 45:20-28.

Van Bruggen, A. H. C., A. M. Semenov and V.V. Zelenev. 2000. Wave-like distributions of microbial populations along an artificial root moving through soil. Microbial Ecology 40:250-259.

Zhou, J., B. Xia, D.S. Treves, L.-Y. Wu, T.E. Marsh, R.V. O’Neill, A.V. Palumbo en J.M. Tiedje (2002) Spatial and resource factors influencing high microbial diversity in soil. Applied and Environmental Microbiology 68:326-334.

Databases met sequentie gegevens van verschillende soorten en genen

Voor vragen of opmerkingen n.a.v. dit artikel kunt u mailen met:

Dit artikel is een publicatie van Nederlands Instituut voor Biologie (NIBI).
© Nederlands Instituut voor Biologie (NIBI), sommige rechten voorbehouden
Dit artikel publiceerde NEMO Kennislink op 25 september 2003

Discussieer mee

0

Vragen, opmerkingen of bijdragen over dit artikel of het onderwerp? Neem deel aan de discussie.

NEMO Kennislink nieuwsbrief
Ontvang elke week onze nieuwsbrief met het laatste nieuws uit de wetenschap.